支原体肺炎患儿肺泡灌洗液MP-DNA载量、免疫炎性指标与治疗效果的关系研究

庞卫花 刘永涛 曹智丽 李金巍 陈珊 林晓燕 杨敬芳

肺炎支原体肺炎(MPP)是好发于儿童和青少年的常见呼吸系统疾病，由MP感染所致。其中难治性MPP患儿病情危重，治疗难度大，不仅造成肺部炎性，严重者还引起心脏、肾脏、血液等多器官、多系统损害，对患儿生命安全造成极大危害[1]。目前，MPP发病机制仍未阐明，研究认为免疫炎性损害是该病发生发展的关键环节[2,3]。有文献报道，MPP患儿肺泡灌洗液(BALF)中高菌量可诱导细胞因子异常表达，导致免疫功能紊乱[4]。本研究观察MPP患儿肺泡灌洗液(BALF)中MP-DNA载量、细胞因子、T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白变化，分析其与病情严重程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年10月至2016年6月我院诊治的MPP患儿75例，分为轻症MPP组(n=35)和重症MPP组(n=40)。轻症MPP组：男21例，女14例；年龄2～14岁，平均年龄(8.41±1.09)岁。重症MPP组：男25例，女15例；年龄2～13岁，平均年龄(8.45±1.13)岁。另选取30例健康体检儿童为对照组，男16例，女14例；年龄2～14岁，平均年龄(8.12±1.10)岁。3组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合小儿支原体肺炎诊断标准[5]：患儿主要表现为发热、咳嗽等症状，胸片检查显示肺部大片阴影，肺纹理增粗；②血清IgM抗体呈阳性；③年龄1～14岁；④就诊前2个月内未接受过相关治疗；⑤患儿家属知情同意。

1.2.2 排除标准：①伴有哮喘、肺结核等其他呼吸系统疾病者；②合并重要脏器功能不全者；③血液系统、免疫系统疾病患儿；④对本研究使用药物过敏者。

1.3 治疗方法 患儿给予降温、止咳、平喘等对症处理。常规治疗基础上给予阿奇霉素和布地奈德悬液治疗。阿奇霉素10.0 mg/kg+250 ml 5%葡萄糖注射液，静脉滴注，1次/d，连用3 d后停药4 d，改为口服给药，10.0 mg/kg，1次/d。布地奈德悬液2 ml/次+5 ml 0.9%氯化钠溶液，雾化吸入，2次/d。疗程2周。

1.4 观察指标

1.4.1 BALF收集:患儿麻醉后将纤维支气管镜送达支气管各段开口处，用37℃ 0.9%氯化钠溶液对右肺中叶支气管肺泡进行灌洗，剂量为0.5～1 ml/kg，灌洗3次后回收灌洗液，置于无菌容器中送检。

1.4.2 MP-DNA载量:采用ABI 7500 荧光定量PCR仪测定MP-DNA载量，参照试剂盒说明书操作。MP-DNA>400 copies/ml即可判定为阳性。

1.4.3 细胞分类:收集BALF中细胞，瑞氏染色后于油镜下计数200个细胞并分类。

1.4.4 细胞因子:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3含量。

1.4.5 T淋巴细胞亚群:采用流式细胞术测定BALF中CD3+、CD4+、CD8+，计算CD4+/CD8+。

1.4.6 免疫球蛋白:采用免疫散射比浊法测定BALF中IgA、IgG、IgM。

2 结果

2.1 3组BALF中MP-DNA载量、MP-DNA阳性率、细胞含量比较 不同程度MPP患儿BALF中MP-DNA载量、MP-DNA阳性率、中性粒细胞百分比均明显高于对照组，巨噬细胞百分比均明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 3组BALF中MP-DNA载量、MP-DNA阳性率、细胞含量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

2.2 3组BALF中细胞因子、共刺激分子比较 不同程度MPP患儿BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别 IL-4IL-17IL-18IFN-αsB7-H3对照组(n=30) 16.79±2.528.56±1.1327.82±4.0712.51±1.3836.25±4.98轻症MPP组(n=35)57.34±18.98*44.23±15.79*69.41±18.13*44.05±12.27*71.76±20.53*重症MPP组(n=40)92.11±27.08*#83.64±26.36*#115.32±22.76*#69.42±18.45*#124.51±26.65*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

2.3 3组BALF中T淋巴细胞亚群比较 不同程度MPP患儿BALF中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明显低于对照组，CD8+均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 3组BALF中免疫球蛋白比较 不同程度MPP患儿BALF中IgA、IgG、IgM均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.5 MPP组治疗前后BALF中MP-DNA载量、MP-DNA阳性率、细胞含量比较 MPP组患者治疗后不同程度MPP患儿BALF中MP-DNA载量、MP-DNA阳性率、中性粒细胞组百分比均明显低于治疗前(P<0.05)，MPP组患者巨噬细胞百分比均明显高于治疗前，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

组别 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+对照组(n=30) 43.20±6.0934.89±5.0417.24±3.121.67±0.23轻症MPP组(n=35)34.86±5.24*25.65±4.23*26.41±4.00*1.12±0.15*重症MPP组(n=40)27.14±4.12*#18.99±3.12*#32.17±4.13*#0.78±0.10*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

组别IgAIgGIgM对照组(n=30) 1.60±0.2212.31±1.451.62±0.23轻症MPP组(n=35)1.21±0.14*8.45±1.12*1.29±0.17*重症MPP组(n=40)0.83±0.13*#5.89±0.78*#1.00±0.13*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

组别MP-DNA载量(log,MP-DNA copy/ml)中性粒细胞(%)巨噬细胞(%)MP-DNA阳性率[例(%)]轻症MPP组(n=35) 治疗前4.96±0.7214.06±2.1174.98±8.5523(65.71) 治疗后3.49±0.58*8.21±1.23*80.33±9.15*15(42.86)*重症MPP组(n=40) 治疗前6.79±0.8321.22±3.3468.23±7.3937(92.50) 治疗后5.00±0.93*#14.98±2.25*#73.79±8.46*#25(62.50)*#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

2.6 MPP组治疗前后BALF中细胞因子、共刺激分子比较 治疗后不同程度MPP患儿BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3均明显低于治疗前(P<0.05)。见表6。

组别IL-4IL-17IL-18IFN-αsB7-H3轻症MPP组(n=35) 治疗前57.34±18.9844.23±15.7969.41±18.1344.05±12.2771.76±20.53 治疗后46.23±12.43*32.56±10.52*48.98±13.26*32.67±9.13*58.45±15.21*重症MPP组(n=40) 治疗前92.11±27.0883.64±26.36115.32±22.7669.42±18.45124.51±26.65 治疗后65.47±22.56*#59.61±21.06*#70.23±16.12*#48.00±12.56*#79.24±20.73*#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

2.7 MPP组治疗前后BALF中T淋巴细胞亚群比较 治疗后不同程度MPP患儿BALF中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明显高于治疗前，CD8+均明显低于治疗前(P<0.05)。见表7。

组别CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+轻症MPP组(n=35) 治疗前34.86±5.2425.65±4.2326.41±4.001.12±0.15 治疗后39.00±6.22*30.79±5.50*21.06±3.78*1.38±0.18*重症MPP组(n=40) 治疗前27.14±4.1218.99±3.1232.17±4.130.78±0.10 治疗后32.31±5.06*#24.90±5.12*#27.23±5.22*#0.99±0.16*#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

2.8 MPP组治疗前后BALF中免疫球蛋白比较 治疗后不同程度MPP患儿BALF中IgA、IgG、IgM均明显高于治疗前(P<0.05)。见表8。

组别IgAIgGIgM轻症MPP组(n=35) 治疗前1.21±0.148.45±1.121.29±0.17 治疗后1.40±0.23*11.76±1.56*1.48±0.20*重症MPP组(n=40) 治疗前0.83±0.135.89±0.781.00±0.13 治疗后1.13±0.19*#8.09±1.12*#1.22±0.19*#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与轻症MPP组比较，#P<0.05

3 讨论

MP是引起呼吸系统感染性疾病的重要致病菌。MP感染不仅引起高热、剧烈咳嗽、呼吸困难等肺部表现，也容易引起多种肺外并发症，严重者出现多器官功能衰竭，病死率高[6,7]。近年来，难治性RMPP发病率逐年升高，且呈低龄化趋势，该病治疗周期长、治疗效果差、并发症多，患儿生命健康受到极大威胁，已经成为临床工作的重点和难点。

文献报道，MPP患儿BALF中MP载量与疾病临床特征具有相关性，高MP载量患儿较低MP载量患儿病情严重，因而降低MP载量是提高临床疗效，延缓疾病进展为RMPP的关键环节[8]。此外，MP感染时机体主要利用巨噬细胞的吞噬作用清除病原体，这会造成巨噬细胞含量减低，同时肺泡腔中性粒细胞浸润明显，并与肺损伤严重程度呈正相关[9]。本研究结果显示，不同程度MPP患儿BALF中MP-DNA载量、MP-DNA阳性率、中性粒细胞百分比均明显高于对照组，巨噬细胞百分比均明显低于对照组(P<0.05)，且治疗后以上指标均明显改善，提示MPP病情严重程度与MP-DNA载量及免疫细胞数量有关，重症MPP患儿体内致病菌难以清除，从而诱发强烈的免疫炎性反应。

MP感染后能够与宿主细胞膜表面受体结合直接造成细胞损伤，同时MP可刺激中性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞分泌IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α等细胞因子以抵御病原菌侵袭，同时进一步引起中性粒细胞、淋巴细胞的广泛浸润[10]。sB7-H3是共刺激分子B7家族成员，在健康人血清含量极低，而在MPP患儿血清sB7-H3水平增高，通过调节细胞免疫应答在疾病发生发展中发挥重要作用[11]。本研究结果显示，不同程度MPP患儿BALF中IL-4、IL-17、IL-18、IFN-α、sB7-H3均明显高于对照组(P<0.05)，且治疗后以上指标均明显改善，提示过度炎性反应及细胞因子的大量释放是导致MPP患儿预后不良的重要原因，经积极干预后MP和炎性反应被显著抑制。

研究显示，MPP感染可诱发机体免疫功能紊乱，其中细胞免疫和体液免疫均参与MPP发生发展[12]。T淋巴细胞是机体介导细胞免疫应答的主要细胞，其中CD3+水平能够反映T淋巴细胞活化程度，CD4+为辅助性T淋巴细胞，具有抵御、吞噬致病菌等作用，CD8+为抑制性T淋巴细胞，可有效抑制免疫应答并发挥细胞毒作用。另外，MP可直接刺激B淋巴细胞产生IgA、IgG、IgM，通过介导体液免疫应答在抵御病原体侵袭过程中发挥重要作用。其中IgA是机体清除、杀灭细菌、病毒、支原体的主要免疫球蛋白；IgM主要参与早期免疫应答过程，并可作为MPP诊断的血清学指标，检测其水平能够反映疾病严重程度；IgG是机体含量最多免疫球蛋白，在免疫应答晚期其水平升高，主要发挥中和游离外毒素等作用[13]。既往研究表明，MPP患儿外周血细胞免疫和体液功能紊乱，与疾病严重程度密切相关[14]。本研究结果显示，不同程度MPP患儿BALF中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgA、IgG、IgM均明显低于对照组，CD8+均明显高于对照组(P<0.05)，且治疗后以上指标均明显改善，提示MP感染可能诱导机体免疫失衡，T淋巴细胞亚群和免疫球蛋白变化可做为评估MPP病情的指标，经积极干预后患儿免疫抑制状态能够显著缓解。

综上所述，MPP患儿BALF中MP-DNA载量、免疫炎性指标表达异常，且与病情严重程度密切相关，可作为判断疾病治疗效果及预后的参考依据。