PTEN基因不同表达的黑色素瘤动物模型建立及鉴定

杨月美 李 宁 孙 旭 王君妍 白冰清

黑色素瘤是由源于神经嵴的黑色素细胞异常增殖而形成的恶性肿瘤。据统计口腔黑色素瘤占口腔肿瘤的0.5%，占全身黑色素瘤的0.2%～8%，每10万例亚洲人或太平洋岛民中有0.17 例的口腔黑色素瘤患者[1]。对口腔粘膜黑色素瘤患者进行回顾性分析结果表明，完全切除根治性治疗的预后较好[2]，但原发于口腔的黑色素瘤表现出向深层组织浸润，不易观察且具有高转移、易复发、易经淋巴结转移的特点，80%病例发现时已经发生了转移，无法实现根治性切除，并且口腔黑色素瘤预后比皮肤黑素瘤差，总体5 年生存率为10～25%[3]。目前尚无合理有效的治疗药物。Dong.Y 等人体外实验证实，PTEN 基因通过调节剂对黑色素瘤细胞的宿主免疫应答发挥抑制剂的作用[4]。有研究证实PTEN 表达的丧失改变了细胞因子分泌模式，从而产生免疫抑制性微环境，并增加可促进肿瘤进展的免疫细胞群，从而促进免疫逃逸[5]。因此，我们旨在构建PTEN 基因不同表达的黑色素瘤小鼠模型，为进一步研究PTEN 基因的不同表达在黑色素瘤免疫逃逸中的作用机制及黑色素瘤的发病机理、临床药物研发提供合适模型。

资料和方法

一、实验材料

1.动物：15 只雄性 C57BL/6 小鼠，6～8 周，18～21 克，购自河北医科大学动物中心（许可证号SCXK（京）2019-0006）。

2.细胞：（PTEN+/+-B16F10）细胞株（购于中桥新舟公司）。

3.主要试剂：BbsI 酶（NEB 公司）质粒抽提试剂盒 （ 北京天根生物科技有限公司）Lipofectamine@3000 转染试剂（THERMO 公司）高保真 DNA 聚合酶（TOYOBO 公司）兔抗人 PTEN 单克隆抗体（MILLIPORE 公司）鼠抗人GAPDH 单克隆抗体（ABCOM 公司）辣根过氧化物酶标记抗兔IgG（上海泊湾生物技术有限公司）

二、研究内容

1.敲除细胞株PTEN 基因

（1）1gRNA 的设计：利用 Cas9/gRNA 网站（http://crispr.mit.edu/） 为 PTEN 基因（位置 8960） 设计gRNA 碱 基 序 列：PTEN-gRNA F:CACCGGCTAAC GATCTCTTTGATGA；PTEN-gRNA R:AAACTCATCA AAGAGATCGTTAGCC

（2）载体构建：通过BbsI 酶切链接反应装到改造的PX330 载体（含有嘌呤霉素筛选基因）。①gRNA：gRNA 由invitrogen 公司合成后，稀释至作用浓度20μM；②合成的gRNA 寡核苷酸单链退火成双链：5μl F+R（20μM），5μl buffer2，双蒸水 50μl，置于沸水后自然冷却至室温；③连接体系:PX330 质粒 1μl，退火形成双链的 gRNA 3μl，T4 连接酶 0.5μl，T4DNA 连接酶buffer 1μl，25℃连接2h；④转化：感受态细胞（DH5a）50μl，加入 5μl 连接产物，冰上孵育30min，42℃水浴锅热激，冰上放置2min 后，转移20μl 混合液至含有氨苄青霉素的LB 固态培养基上涂匀，37℃培养16h 取出；⑤挑菌送测序：挑取单克隆置于1ml 含有Amp 抗生素的LB 液体培养基中，摇菌8h 后，按照质粒提取试剂盒说明书提取和纯化质粒PX330-PTEN-gRNA，送至铂尚生物技术有限公司测序验证。

（3）细胞转染：复苏（PTEN+/+-B16F10）细胞传代至密度达到60%左右时按照Lipofectamine@3000 转染试剂说明将质粒PX330-PTEN-gRNA 进行转染。

（4）PTEN 基因敲除细胞的筛选：PX330-PTEN-gRNA 质粒转染入细胞48h 后，将存活的细胞重新消化，并按一定的密度培养单克隆细胞系，细胞扩增并编号冷冻大部分，剩余部分分别用高保真DNA 聚合酶PCR 扩增gRNA 结合的序列，鉴定PCR 的引物序列F：（5'CCGCTGCCTCGGCTGC CAGGCC3'）和R：（5'AGGTCAAGTCTAAGTCGAATC C3'），引物由invitrogen 公司合成，所得产物送铂尚公司测序分析，获得阳性敲除细胞株（PTEN-/--B16F10）。

2.细胞培养

两种细胞分别置于含10%灭活胎牛血清、1%双抗的 RPMI-1640 培养液，37℃，5%CO2恒温培养。

3.动物分组

15 只小鼠随机分为三组，每组五只，背部正中备皮，面积约为2cm×2cm，75%乙醇消毒。对照组：注入0.2ml 的RPMI-1640 培养液；实验组A：注入0.2ml浓度为 4×106/ml 的（PTEN+/+-B16F10）；实验组 B：注入 0.2ml 浓度为 4×106/ml 的（PTEN-/--B16F10）。

4.记录

自注射日起，每天观察小鼠进食、行动情况，待实验组所有小鼠背部均触及绿豆大小黑结节时，当天视为出瘤日（D0）。以四天为一观察单位测量小鼠肿瘤的长径（a）短径（b），V＝ab2/2（mm3）计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。至实验组小鼠80%出现精神萎靡时停止实验。

5.标本采集及处理

小鼠脱颈后取下肿瘤组织，称重并分别取100mg A、B 两组小鼠肿瘤组织新鲜标本，提蛋白后-80℃保存。

6.组织蛋白鉴定

提取两种细胞蛋白，测定蛋白浓度，加缓冲液后煮沸，按等量的总蛋白上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100V 恒压转模1h，5%脱脂奶粉封闭1h，将兔抗人PTEN 单克隆抗体和兔抗人GAPDH 单克隆抗体用稀释液稀释，比例均为1:3000，4℃孵育摇床过夜、漂洗；辣根酶标记山羊抗兔IgG，稀释，比例为1:2500，孵育1h，化学发光、显影、压片。

7.结果分析

SPSS25.0 软件处理数据。均值 -T 检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1.两种细胞PTEN基因测序

为鉴定PTEN 基因敲除效果，提取克隆细胞DNA 测序分析，与原基因序列相比，转染质粒后细胞基因测序缺少一个碱基。据编码规律，三个碱基编码一个氨基酸，后面碱基全部移码错位，致PTEN蛋白缺失表达。

2.细胞培养

与（PTEN-/--B16F10）相比，（PTEN+/+-B16F10）形态较扁长，生长速率较慢。

3.荷瘤小鼠生长状态

注射第7 天（D0），实验组小鼠背部均可触及绿豆大小质硬结节；生长过程中可见肿瘤破溃结痂现象，周围有明显血管；注射第16 天，实验组80%小鼠精神萎靡停止实验。

4.记录数据并绘制曲线

分别在 D0、D4、D8、D12、D16 天测量 A、B 两组肿瘤体积，记录并绘制肿瘤生长曲线。A 组小鼠肿瘤生长速度小于B 组，两组比较有统计差异（D0，P＝0.011；D4，P＝0；D8，P＝0.005；D12，P＝0；D16，P＝0.005）。

5.细胞及肿瘤组织免疫印迹结果

图1 （PTEN+/+-B16F10）基因组原始测序结果

图2 （PTEN+/+-B16F10）和（PTEN-/--B16F10）靶序列编码氨基酸的变化

图3 相同状态下细胞图像（荧光倒置显微镜 ×100）

图4 注射当天、D0、D4、D8、D12、D16 天三组小鼠

表1 两组小鼠肿瘤体积参数比较（平均值±标准差）

图5 小鼠肿瘤体积随时间变化的图像

图6 免疫印迹检测细胞和肿瘤组织PTEN 表达

提取两种细胞和成瘤组织中的蛋白检测，可观察到（PTEN+/+-B16F10）细胞和A 组小鼠肿瘤标本中PTEN 蛋白表达，（PTEN-/--B16F10）细胞和 B 组小鼠肿瘤标本中PTEN 蛋白不表达。

讨 论

1997 年，PeterA.Steck 等人首次发现 10q23.3 染色体的TEP1/MMAC1 是一个抑癌基因，后改名为PTEN，该基因与人类多种恶性肿瘤形成有关[6]。在黑色素瘤中，PTEN 的失活多达30%[7]。在细胞实验中，通过敲除PTEN 基因可以模拟机体PTEN 失活的状态。自2013 年Cong L 等人运用CRISPR-Cas9 系统在真核细胞进行基因编辑以来，CRISPR-Cas9 技术获得迅猛发展，在基础研究中，尤其是在涉及致癌作用的单基因功能研究中至关重要。由于肿瘤发生和发展是多种遗传改变，目前该技术可以模拟基因突变和缺失，用来产生细胞和动物模型以了解该基因在肿瘤发生中的作用[8，9]。Cas9/gRNA 在基因编辑中具有高效性和特异性，可用于编辑DNA 或调节真核细胞和生物体中基因表达[10]。2018 年，Shen Y 等人用CRISPR/Cas9 技术敲除骨髓间充质干细胞系中的 PTEN 基因生成了 PTEN-KO 细胞系[11]；2019 年，Simbulan 等人运用CRISPR-Cas9 技术发现：CD133可能通过上调基质金属蛋白酶MMP2/MMP9 而在侵袭和转移中起重要作用，导致肿瘤进展[12]。2019 年，Colette Moses 等人运用CRISPR-Cas9 技术成功在BRAF 突变黑素瘤 SK-MEL-28 中特异性激活PTEN[13]。可见运用该技术敲除PTEN 基因是建立PTEN 基因缺失动物模型的技术关键。本实验中运用 CRISPR-Cas9 技术成功敲除（PTEN+/+-B16F10）细胞的 PTEN 基因，构建了（PTEN-/--B16F10）细胞系。

使用荷瘤小鼠模型可以在动物体内观察黑色素瘤对动物免疫功能的影响，这种体内实验比体外实验更有说服力。黑色素瘤的发生是免疫系统减弱同时机体内环境发生变化而促进黑色素瘤生长。本实验建立PTEN 基因缺失表达的体内模型，能控制唯一变量研究PTEN 基因与黑色素瘤两者之间的关系。B16F10 细胞是C57BL/6 小鼠来源的，与裸鼠相比能模拟机体免疫系统减弱的过程，使免疫排斥降到最低，这更符合患者黑色素瘤发生的体内过程，为此我们选C57BL/6 小鼠作为载体。本实验将两种细胞接种到小鼠皮下，7 天均能在小鼠皮下形成绿豆大小的实体瘤，两组小鼠的成瘤率均为100%。结果分析A、B 两组小鼠肿瘤体积比较均有统计学差异（P＜0.05），说明PTEN 基因与肿瘤的生长有相关性。

研究细胞分子性状在动物模型上是否发生变化，常采用免疫印迹技术。此技术可用来鉴定、半定量分析细胞和肿瘤组织的目的蛋白，因特异性强，灵敏度高及成本低等优点广泛用于实验[14]。本实验用免疫印迹检测PTEN 蛋白表达情况。结果显示两种细胞在接种前后PTEN 蛋白均能保持原状态，（PTEN+/+-B16F10） 细胞与A 组小鼠肿瘤组织中PTEN 蛋白表达呈阳性，（PTEN-/--B16F10）细胞与 B组小鼠肿瘤组织中PTEN 蛋白表达呈阴性，证实模型鉴定成功。