益生菌发酵牦牛肉血肠的制作工艺优化

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

中国是世界上拥有牦牛数量最多的国家,约占世界牦牛总数的95%,存栏数约有一千三百多万头[1]。血液作为牦牛屠宰加工中的主要副产物,是十分理想的蛋白质资源。研究发现,牦牛全血、血浆和血细胞的蛋白质含量分别为15.5%±0.8%、6.9%±0.7%、32.7%±0.9%[2-3],但是长期以来这些血液大都作为废弃物被排放掉,既造成环境污染,也是很大的浪费。目前,国内通常利用畜禽血液制作血豆腐、血丸子和血肠[4-5]等;西班牙北部Burgos周边地区血肠则由洋葱、大米、动物脂肪、血液混合而成[6];在日本,一些厂家用血红素作为香肠着色剂,用血浆粉代替肉原料制作香肠[7],但都是未发酵产品。发酵香肠是指将绞碎的肉、发酵剂和其他辅料按适当比例混合后灌入肠衣,经微生物发酵制成的发酵肉制品,具有稳定的微生物特性和典型发酵香味[8]。发酵香肠的口味独特、香味浓郁,在我国有很大市场潜力[9]。乳酸菌作为一种应用于发酵肉制品的主要益生菌[10],其产生的有机酸可以使钙、磷、铁的利用率提高,促进人体吸收[11]。制作发酵牦牛血肠,不仅可以有效利用牦牛血资源,还可以生产出一种高蛋白、低脂肪、易消化吸收又有其独特风味的产品。李福存[12]对发酵鸭血肠工艺进行了研究,发现鸭血添加量为25%,菌种接种量为107cfu/g,在30 ℃发酵18 h后的血肠品质最佳。黎美莲等[13]探讨了不同鹅血添加量对鹅血香肠质构和感官特性的影响,发现鹅血的添加量为16%时,香肠的质构、色泽和口感较好。

目前,采用牦牛血制作发酵牦牛血肠尚未见报道。本研究采用牦牛血制作益生菌发酵牦牛血肠,旨在优化牦牛发酵血肠制作工艺参数,筛选出最适制作工艺,同时考察不同牦牛血添加量、发酵温度、发酵时间以及菌种添加量对发酵牦牛血肠品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛血、牦牛肉(背最长肌) 红原牦牛屠宰厂;猪肠衣、氯化钠、三聚磷酸钠、抗坏血酸、谷氨酸钠、五香粉、葡萄糖 购于成都本地市场;植物乳杆菌 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;戊糖片球菌 购于四川省微生物资源平台菌种保藏中心;MRS肉汤、MRS培养基 均为生物试剂,由杭州微生物试剂有限公司提供。

PL30型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;MP511型实验室pH计 上海三信仪表厂;MDF-U4086S超低温冰箱 三洋电器有限公司;DHG-9240A电热恒温鼓风恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;TA.TX Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司;CR-400色彩色差仪 日本KONICA MINOLTA公司;JYL-C022E料理机 九阳股份有限公司;DHP-9052电热恒温培养 上海齐欣科学仪器有限公司;SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵剂制备 参考王恺等[14]的方法并稍作修改。分别将植物乳杆菌和戊糖片球菌按V(菌液)∶V(培养基)=1∶15的比例接种于MRS肉汤中,在37 ℃恒温培养箱内培养24 h,重复上述操作两次。培养基明显浑浊时,表明活化完成,4 ℃冰箱备用。利用MRS琼脂培养基对完成活化的菌种进行平板计数。

1.2.2 血肠制作

1.2.2.1 工艺流程

1.2.2.2 操作步骤 选择牦牛肉背最长肌,修整除去筋膜、筋腱,清水清洗除去杂质和油腻后沥干水分;牦牛血经双层纱布过滤,除去杂物,备用;将原料肉切成长、宽、高均为 4～5 cm 的肉丁后放入料理机中通过5 mm孔径筛板绞成均匀的肉馅;在肉馅中加入适量牦牛血及食盐3.0%、三聚磷酸钠0.3%、抗坏血酸0.03%、谷氨酸钠0.05%、五香粉0.4%、葡萄糖1.0%,搅拌均匀;植物乳杆菌与戊糖片球菌以1∶1的比例(107cfu/g)分别接种于肉馅中;搅拌后的肉馅采用人工灌肠方式灌制在天然肠衣中,灌制过程中应注意肉馅分布均匀松紧适度,防止灌得过饱而胀破肠衣;灌装好的肠体每隔10～20 cm用线绳结扎,用排气针扎眼,排除空气;温水漂洗肠体去除表面污物和杂质,然后将处理好的血肠体置于恒温培养箱中发酵;发酵完成后放入沸水水浴锅中持续加热10 min;擦干肠衣表面水分后自然冷却至室温;贮藏备用[15-16]。

1.2.3 单因素实验 参考李福存[12]的实验方法并修改,考察不同牦牛血添加量、发酵温度、发酵时间以及菌种添加量对发酵牦牛血肠品质的影响。

1.2.3.1 牦牛血添加量对血肠品质的影响 牦牛血添加量分别为15%、20%、25%、30%、35%,菌种添加量为1%,以未添加牦牛血的灌肠为对照,于30 ℃发酵18 h,以pH、蒸煮损失率、感官、色差、质构为评价指标,确定最适牦牛血添加量,其中感官评价为首要考虑指标。

1.2.3.2 发酵温度对血肠品质的影响 牦牛血添加量为20%,菌种添加量为1%,分别于20、25、30、35、40 ℃发酵18 h,以pH、蒸煮损失率、感官、色差、质构为评价指标确定最适发酵温度,其中感官评价为首要考虑指标。

1.2.3.3 发酵时间对血肠品质的影响 牦牛血添加量为20%,菌种添加量为1%,于30 ℃分别发酵14、16、18、20、22 h,以pH、蒸煮损失率、感官、色差、质构为评价指标确定最适发酵时间,其中感官评价为首要考虑指标。

1.2.3.4 菌种添加量对血肠品质的影响 牦牛血添加量为20%,菌种添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,于30 ℃发酵16 h,以pH、蒸煮损失率、感官、色差、质构为评价指标为评价指标,确定最适菌种添加量,其中感官评价为首要考虑指标。

1.2.4 正交试验设计 根据牦牛血添加量、发酵温度、发酵时间以及菌种添加量的单因素试验结果,经过数据分析筛选后,采用L9(34)表设计4因素3水平正交试验,以pH、蒸煮损失率、感官评分为评价指标优化发酵牦牛血肠工艺条件,其中感官评分为主要评价指标。

1.2.5 理化指标测定

1.2.5.1 pH的测定 参考Yang等[17]和王德宝等[18]的方法并略作修改。称取3 g切碎的血肠,加入27 mL蒸馏水混匀,静置30 min后用pH计测定上清液pH。

1.2.5.2 蒸煮损失测定 根据Al-Bachira等[19]报道的方法,并进行改进。将样品称重(W1)后封口包装,放入沸水水浴锅中持续加热10 min。样品冷却至室温后,开封用滤纸轻轻擦干肉样表面水分,称重(W2)。

式中:W1:初始样品质量;W2:煮制降温后样品质量。

1.2.5.3 色差的测定 将血肠切成高2.5 cm,半径1.5 cm的圆柱体,用色差计测定血肠的L*值、a*值和b*值,每个样品上随机取三点进行测定[20]。

1.2.6 感官评分 感官评定前,邀请5位食品专业人员进行培训,对发酵血肠外观、组织形态、色泽、气味四个方面进行感官评定,评分标准见表2[12]。

表2 发酵血肠感官评价标准Table 2 Standard for sensory evaluationof fermented blood sausage

1.2.7 质构的测定 采用质构仪测定发酵牦牛血肠的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性[21]。将血肠切成高2.5 cm,半径1.5 cm的圆柱体,采用TPA模式,探头为P/0.5S球形探头,测前下降速度1.0 mm/s、测试速度1.0 mm/s、测后上升速度1.0 mm/s,负载类型为Auto-5.0 g,数据采集速度为200 pp/s。

1.3 数据分析

所有样本处理重复3次,使用SPSS V19.0分析数据,采用ANOVA进行方差分析和显著性检验、Duncan法进行多重比较,显著性水平为P<0.05,做图表使用Excel 2010软件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 牦牛血添加量对血肠品质的影响 由表3可知,发酵血肠的pH在4.40至4.48之间;蒸煮损失率随着血添加量的增加呈先减少后增加的趋势(P>0.05);当血添加量较少时,牦牛血与肉的粘结性不是很好,因此有较高的蒸煮损失率;当血添加量逐渐增加时,牦牛血与牦牛肉可以较好的结合,蒸煮损失率降低,此外,蛋白质含量增加可以提高血肠蒸煮过程的持水性[22],这可能也是血肠的蒸煮损失率降低的原因之一;当血添加量继续增加时,由于血液中水分含量较多,可能会导致蒸煮损失率增加;感官评分则先增加后减少(P<0.05),血添加量为20%时发酵血肠的pH为4.41,蒸煮损失率为23.83%,感官评分为93.90分。

表3 血添加量对发酵血肠理化指标和感官品质的影响Table 3 Effects of blood addition on physicochemical propertiesand sensory quality of fermented blood sausage

由图1可以看出,随着血添加量的增加,L*值、a*值呈逐渐下降趋势,b*值呈先下降后上升的趋势。肌红蛋白是肉的主要呈色物质,血红蛋白则是牦牛血的主要呈色物质,二者与氧气结合会产生鲜红色,但受热会变成灰褐色的高铁蛋白,使血肠颜色变暗、红色加深。这是因为肉和血中的Fe2+在高温下被氧化成Fe3+,形成血肠特有的色泽,牦牛血量过多时,无法保持原先的色泽,使血肠的颜色过深[13]。添加牦牛血可以对血肠进行着色,赋予血肠独特的红色。牦牛血中含有丰富的蛋白质、糖、脂肪等有机物及无机盐、微量元素等无机物,可增加血肠的营养物质含量[13]。牦牛血添加量为15%时,发酵血肠有最大的色差值,此时发酵血肠颜色最好。

图1 血添加量对发酵血肠色差的影响Fig.1 Effect of blood addition on colorchanges of fermented blood sausage

根据表4可知,随着血添加量的增加,发酵血肠的硬度和咀嚼性呈先下降后上升又下降的趋势,弹性呈先增加后减少的趋势,内聚性呈先上升后下降又上升的趋势。硬度是指食品变形或穿透产品所需的力,是保持食品形状的内部结合力;弹性表示在外力作用下发生形变后的物体在撤除外力后恢复原来状态的能力;内聚性反映咀嚼食物时食物抵抗受损并紧密连接,使食物保持完整的性质[23-24]。有研究表明香肠的硬度和咀嚼性与蛋白变性有关[25],血肠煮制后蛋白变性,牦牛血添加量不同导致血肠中蛋白质含量不同,煮制后蛋白变性程度也不同,从而影响血肠的硬度和咀嚼性。血添加量为15%时,发酵血肠的硬度和咀嚼性最高(P<0.05),此时产品口感过硬,感官评分较低;血添加量为20%时,发酵血肠的硬度为1920.11 g,弹性为0.66,内聚性为0.62,咀嚼性为782.41 g,回复性为0.08,此时,发酵血肠有较高的硬度和咀嚼性,弹性和内聚性较好,且感官评分最高,口感细腻。

表4 血添加量对发酵血肠质构的影响Table 4 Effect of blood addition on texture of fermented blood sausage

综上所述,当牦牛血添加量为15%时,发酵牦牛血肠的色泽和质构最好,但蒸煮损失率较大,感官评分低;牦牛血添加量为20%时,有较合适的pH、较低的蒸煮损失率和较好的色泽,且发酵血肠外形美观,具有独特的风味,肉质细腻且弹性足,咀嚼良好,切面平整,肉质紧密。香气浓郁,无血腥气味,因此选择牦牛血添加量为20%。

2.1.2 发酵温度对血肠品质的影响 从表5可以看出,当发酵温度在20～25 ℃时,益生菌活性受到抑制,产酸较慢,发酵后pH较高。发酵温度在30～35 ℃时,益生菌的活性较稳定,pH差异不显著(P>0.05)。当温度为40 ℃时,益生菌活性进一步提高,产酸能力加强,pH显著下降(P<0.05)。随着发酵温度的增加,感官评分呈先上升后下降的趋势。当发酵温度为30 ℃时,发酵血肠的感官评分最高,为86.00分。而此时发酵血肠的蒸煮损失率最低,为14.92%。

表5 发酵温度对血肠理化指标和感官品质的影响Table 5 Effects of fermentation temperature onphysicochemical properties and sensory quality of blood sausage

色泽是评价发酵香肠品质的重要指标之一,色泽的变化与肉中肌红蛋白及血中血红蛋白被氧化成高铁肌红蛋白有关,此外,还与脂肪氧化、氧化还原酶系、氧化还原电位、氧分压等因素有关[24]。由图2可知,随着发酵温度的增加,L*值呈波动性上升趋势,a*值和b*值则呈先增加后减少再增加的趋势。当发酵温度达到40 ℃时,L*值、a*值和b*值都显著增加,这可能是因为发酵温度过高,使血肠pH下降,NO2-迅速分解为NO-,NO-与肌红蛋白和血红蛋白分别结合生成亚硝基肌红蛋白和亚硝基血红蛋白,a*值迅速上升[26]。发酵温度为40 ℃时,发酵血肠有较好的色泽,L*值、a*值和b*值分别为23.84,10.70,6.20。

图2 发酵温度对血肠色差的影响Fig.2 Effect of fermentation temperatureon color changes of blood sausage

牦牛血肠的质构变化见表6。发酵血肠的硬度、弹性、内聚性和咀嚼性随发酵温度的增加有上升的趋势(P<0.05),而回复性不受温度的影响(P>0.05),这可能是因为发酵温度越高,pH下降速度越快,促进蛋白质的凝胶作用。研究发现,蛋白质的变性和凝固降低了血肠的持水力,导致水分损失,同时伴随产品质量减轻和直径减小,从而使血肠的结构更加致密[24]。发酵温度在20～25 ℃时,发酵血肠的硬度和咀嚼性较低(P>0.05),发酵温度在30～35 ℃时,发酵血肠的质构无显著性差异(P>0.05),有较好的弹性、内聚性、咀嚼性和回复性。发酵温度为40 ℃时,发酵血肠的硬度、弹性和咀嚼性最高,此时产品口感过硬,感官评分最低。

表6 发酵温度对血肠质构的影响Table 6 Effect of fermentation temperature on texture of blood sausage

综上述,发酵温度在40 ℃时,发酵血肠有较好的色差值,但其pH、蒸煮损失率和感官评分较差,结合感官评分、色差和质构考虑,确定发酵温度在30 ℃时最佳。

2.1.3 发酵时间对血肠品质的影响 如表7所示,随着发酵时间的延长,发酵血肠的pH呈先减少后增加的趋势,蒸煮损失率和感官评分则呈先增加后减少的趋势。当发酵时间为16 h时,发酵血肠的pH为4.92,蒸煮损失率为7.44%,此时的感官评分最高为88.33分。当发酵时间达到22 h时,pH又显著上升(P<0.05),可能是因为此时水分含量下降,体系盐浓度增大,抑制了益生菌的生长繁殖;蛋白质降解产生生物胺[27]以及酶对蛋白质的作用对此结果也有影响[28]。

表7 发酵时间对血肠理化指标和感官品质的影响Table 7 Effects of fermentation time on physicochemicalproperties and sensory quality of blood sausage

发酵香肠主要色素为褐色的球蛋白血色素原,亦有亚硝基高铁血色素原[29]。从图3可以看出,a*值和b*值随着发酵时间的延长呈先上升后下降最后升高的趋势,且在发酵20 h时达到最低,发酵至22 h后,发酵血肠的a*值和b*值均显著增加,而L*值则无显著变化,但此时血肠发酵时间过长,感官评分较低,口感粗糙,略有异味。在发酵初期,血肠中水分含量较高,NaNO2会转变为NO,NO可与肌红蛋白和血红蛋白结合为鲜红色的一氧化氮肌红蛋白和一氧化氮血红蛋白,发酵血肠的a*值升高;随着发酵时间的延续,血肠中水分含量降低,血液内部色素物质浓缩,使血肠颜色逐渐加深,血肠的a*值随之下降[30-31],发酵时间为16 h时,L*值为23.04,a*值为6.43,b*值为2.71。

图3 发酵时间对血肠色差的影响Fig.3 Effect of fermentation timeon the color changes of blood sausage

根据表8可知,随着发酵时间的延长,发酵血肠的硬度呈先增加后减少又增加的趋势,弹性、内聚性和咀嚼性则呈增加趋势,发酵16～18 h时,发酵血肠质构指标差异不显著(P>0.05),发酵16 h的发酵血肠硬度和回复性大于发酵18 h的发酵血肠。发酵20～22 h时,发酵血肠质构指标无显著性差异(P>0.05),硬度显著高于发酵16～18 h的发酵血肠(P<0.05),22 h时的咀嚼性显著高于发酵16～18 h的发酵血肠(P<0.05),发酵22 h后,发酵血肠的硬度和咀嚼性最高,分别为2129.65和1198.02 g。

表8 发酵时间对血肠质构的影响Table 8 Effect of fermentation time on texture of blood sausage

发酵时间为22 h时,发酵血肠的色差值、硬度及咀嚼性较好,但感官评分最低,发酵时间为20 h时,发酵血肠的质构较好,但色差值和感官评分较低,发酵血肠发酵18 h后的pH和蒸煮损失率低于发酵16 h的发酵血肠,但发酵16 h的感官评分,色差值,硬度和回复性较好,综合以上指标,选择最佳发酵时间为16 h。

2.1.4 接种量对血肠品质的影响 由表9可以看出,随着接种量的增加,发酵血肠的pH先下降后上升又下降的趋势,感官评分则呈下降趋势。低的pH能有效抑制微生物的生长繁殖,且促进蛋白质降解为氨基酸和小分子肽,促进脂肪分解为游离脂肪酸和甘油酯,这些分解物均是形成血肠风味的重要前体物,有助于形成发酵血肠特有的风味[26,30]。当接种量增加至1.0%时,此时发酵血肠的pH为4.74,能有效控制病原微生物和腐败微生物的生长繁殖[32],且血肠的感官评分也相对较高,感官评分为82.20分,而其蒸煮损失率为5.32%。当接种量为2.0%时,pH有所上升,可能是因为接种量过高,菌种间会竞争性利用糖原,导致产酸速度缓慢。

表9 接种量对血肠理化指标和感官品质的影响Table 9 Effects of inoculation amount on physicochemicalproperties and sensory quality of blood sausage

根据图4可知,随着接种量的增加,L*值呈上升趋势,a*值则先增加后减少,接种量为2.0%时,a*值和b*值最大,分别为10.79和4.17,接种量在1.0%时b*值最小为2.73。

图4 接种量对血肠色差的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on color changes of blood sausage

从表10中可以看出,发酵血肠的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性都随接种量的增加呈先上升后下降又上升的趋势,这可能是因为益生菌的发酵作用使血肠pH降低,降到蛋白质等电点后,促进蛋白质凝胶化使发酵血肠的硬度、内聚性和咀嚼性增加[33],但当接种量过高时,可能会导致益生菌产生竞争性抑制,无法产生较好的发酵效果,继而影响发酵血肠的质构。接种量在1.0%～1.5%时,硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性差异不显著(P>0.05),接种量为1.5%时发酵血肠有较好的质构,此时,硬度为2219.01 g,弹性为0.84,内聚性为0.69,咀嚼性为1291.35 g,回复性为0.27。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表10 接种量对血肠质构的影响Table 10 Effect of inoculation amount on texture of blood sausage

表10 L9(34)正交试验pH、感官评价、蒸煮损失率结果Table 10 L9(34)orthogonal test results of pH value、sensory quality and cooking loss rate

接种量为1.0%时,pH适中,b*值最小,蒸煮损失率及感官评分在接种量为0.5%时最佳,与接种量为1.0%的发酵血肠差异不显著(P>0.05),接种量为1.5%时,发酵血肠质构最好,与接种量为1.0%时发酵血肠质构指标差异不显著(P>0.05),综合考虑以上指标,选择1.0%为最佳接种量。

2.2 正交试验

由表11极差分析可知,各因素对发酵血肠pH的影响顺序为发酵温度>发酵时间>接种量>血添加量,各因素对发酵血肠感官评价的影响顺序为接种量>血添加量>发酵温度>发酵时间,对蒸煮损失率的影响顺序为血添加量>接种量>发酵时间>发酵温度,其中pH在A2B3C2D3时较为合适,我国消费者对pH过低的发酵血肠接受程度有限,因此,血肠的pH不易过低;蒸煮损失率在工艺参数为在A1B1C3D2时最低;感官评分在发酵牦牛血肠工艺参数为A2B1C2D3时最高,感官评价是对血肠的总体评鉴,感官评价越高,说明发酵血肠的可接受度越高,感官评价为首要考虑指标,包括外观、组织形态、色泽和气味,反映发酵血肠品质,pH影响产品口感,蒸煮损失率表征成品率,综合考虑确定生产发酵牦牛血肠的工艺参数为A2B1C2D3,即感官评分最高组,最适发酵条件为牦牛血添加量20%,发酵温度25 ℃,发酵时间16 h,菌种添加量1.5%,此时，发酵牦牛血肠的pH为5.10，蒸煮损失率为6.76%，感官评分为89.87分，发酵牦牛血肠外形美观,切面整齐,口感细腻,咀嚼良好,无血腥气味。

3 结论

本文通过单因素和正交试验设计,优化发酵牦牛肉血肠生产过程中牦牛血添加量、发酵温度、发酵时间和菌种添加量,并探讨其对发酵牦牛血肠的品质影响。

血添加量对发酵牦牛血肠的pH、感官品质、色差值、质构均影响较大,综合评定20%添加量最适;发酵温度在40 ℃时,发酵血肠有较好的色差值,但其pH、蒸煮损失率和感官评分较差,结合感官评分、色差和质构考虑,确定发酵温度在30 ℃时最适;发酵时间为22 h时,发酵血肠的色差值和质构较好,但感官评分最低,发酵16 h的感官评分,色差值,硬度和回复性较好,选择发酵16 h 为最适发酵时间;接种量为1.0%时,发酵血肠的pH适中,b*值最小,蒸煮损失率及感官评分与接种量为0.5%的发酵血肠差异不显著(P>0.05),综合评定选择1.0%为最适接种量。结合单因素实验结果利用正交试验进一步分析,制作发酵牦牛血肠的最优组合为牦牛血添加量20%,发酵温度25 ℃,发酵时间16 h,菌种添加量1.5%,此时,发酵牦牛血肠的pH为5.10,蒸煮损失率为6.76%,感官评分为89.87分,肠体坚实有弹性、切面平整、质地口感适中、色泽良好、香味浓郁纯正,无血腥气味,综合品质较好良好。