黄酒米浆水中抗菌乳酸菌的筛选及特性分析

(浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015)

黄酒(Huangjiu)是我国民族特产和传统发酵食品之一,通常以糯米为原料,经浸米、蒸煮、加曲、糖化发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成[1-2]。浸米是黄酒生产的第一个工艺,以生产用水对糯米进行浸泡,每生产1吨黄酒约产生2吨米浆水[3]。米浆水富含淀粉、蛋白质、糖类、有机酸等营养物质[3],还含有丰富的细菌,尤其是乳酸菌,含有少量酵母菌和霉菌等类群微生物[4-6],鉴于环境保护和精深加工的需求,黄酒企业一直在探索米浆水的综合、高效利用途径。

近年来,乳酸菌在食品保藏、饲料行业、保健、医疗领域的应用价值被深入挖掘[7-9],我国传统发酵食品蕴含丰富的乳酸菌资源,黄酒米浆水中富含乳酸菌,其代谢产物对黄酒的发酵过程、风味产生及营养价值产生影响[4,6,10]。已有我国传统发酵食品如泡(酱)菜、发酵乳制品中具有抑菌活性乳酸菌的研究报道[11-12],鉴于乳酸菌基因组的多样性大多与其所在的环境有关,尤其与抗生素抗性、糖代谢、蛋白质水解和限制性修饰等功能相关的基因与环境特异性相关[13],亟需深入认识黄酒米浆水中抑菌乳酸菌的类型及生理特性、抑菌物质的理化特性等。革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)的化学组成、生理生化特性不同,有些抑菌物质不能同时对G+和G-有抑制作用,比如成潇龙等[14]研究发现米浆水对金黄色葡萄球菌(G+)有抑菌作用,故本文以致食品腐败菌蜡样芽胞杆菌(G+)和大肠杆菌(G-)为指示菌,对黄酒米浆水中具有抑制G+和G-的乳酸菌进行筛选,并对其特性进行初步分析,为米浆水的开发和综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄酒米浆水 会稽山绍兴酒股份有限公司;大肠杆菌(E.coli,ATCC44102)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus,AS1.2238) 浙江省微生物研究所;MRS培养基、胰酪大豆胨培养基、营养琼脂培养基、琼脂粉、微生物生化反应管 杭州微生物试剂有限公司;CaCO3成都市科龙化工试剂厂;乳酸菌筛选培养基 含0.3% CaCO3MRS固体培养基;乳酸菌活化培养基 MRS液体培养基;乳酸菌保藏培养基 含2%琼脂粉的MRS固体培养基;大肠杆菌活化及培养培养基 营养琼脂培养基;蜡样芽孢杆菌活化及培养培养基 胰酪大豆胨培养基;2%素琼脂 琼脂粉20 g,蒸馏水1 L。

YM30Z灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;LRH-250恒温培养箱 国华仪器有限公司;PHS-25酸度计 上海理达仪器厂;PL303电子分析天平 CX31光学显微镜 日本奥林巴斯有限公司;梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;台式高速冷冻离心机 Biofuge Primo R。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的初筛 采用溶钙圈法[15],取100 μL适当稀释的米浆水涂布于MRS培养基中,37 ℃培养24～48 h,挑取具有透明溶钙圈、形状不同的单个菌落。

1.2.2 抑菌乳酸菌的筛选 参照王伟[16]的方法,首先采用牛津杯法筛选对大肠杆菌和蜡样芽胞杆菌有抑菌活性的乳酸菌,接着通过过氧化氢酶实验筛选过氧化氢酶阴性菌株,所选菌株于MRS固体培养基上保藏,备用。

1.2.3 乳酸菌形态观察及生理生化鉴定

1.2.3.1 菌株形态 将纯化的有溶钙圈的菌株接种于MRS平板上,37 ℃培养2 d,革兰氏染色后显微镜观察,挑取形态不一致菌株,编号,保藏。

1.2.3.2 生理生化鉴定 按半乳糖、乳糖、松三糖、棉子糖、麦芽糖、葡萄糖、七叶苷、马尿酸钠、葡萄糖产气、淀粉水解、精氨酸双水解、吲哚反应、明胶液化生化鉴定管的要求接种乳酸菌,考察乳酸菌的生理生化特性[17-18]。

1.2.4 乳酸菌抑菌活性的测定 将大肠杆菌接种于营养琼脂基液体培养基,37 ℃恒温培养24 h;蜡样芽孢杆菌接种于胰酪胨大豆液体培养基,30 ℃恒温培养24 h;采用牛津杯法[16]考察乳酸菌上清液对指示菌的抑菌性能。

1.2.5 有机酸干扰的排除 参照王伟[16]的方法略有改动,用1 mol/L的NaOH将离心后的发酵液pH调节至5.0,同时分别用乳酸、乙酸和盐酸调节MRS液体培养基pH至5.0作为对照;采用牛津杯法考察乳酸菌发酵上清液、乳酸、乙酸和盐酸对指示菌的抑制活性。

1.3 数据处理

每组实验进行3个平行,用SPSS进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌的分离及部分形态

从黄酒米浆水中筛选出具有抑菌活性的乳酸菌菌株36株,其菌落形态为圆形,乳白色,表面光滑,边缘齐整,不透明,质地均匀,菌体无鞭毛,无芽孢产生,菌落周围有融钙圈。显微镜下,均为杆菌,只是菌株的长宽不一;革兰氏染色后有些菌株呈紫色,有的菌株呈红紫色,说明细胞壁肽聚糖和类脂质含量有差异。菌落形态及显微镜下菌体形态见图1和图2。

图1 乳酸菌菌落及融钙圈Fig.1 LAB colony and calcification ring

图2 几株乳酸菌在显微镜下的菌体状态(400×)Fig.2 The shape of several strains of the lacticacid bacteria under the microscope(400×)

2.2 乳酸菌生理生化特性

对分离得到的36株菌进行生理生化鉴定,从表1可见,36株乳酸菌均能利用葡萄糖、七叶苷及麦芽糖,精氨酸双水解试验、吲哚反应、明胶试验、葡萄糖产气、淀粉水解都为阴性,由葡萄糖产气为阴性得出36株乳酸菌均为同型发酵乳酸菌,也就是说这些菌株发酵己糖几乎全生成乳酸[16]。

表1 乳酸菌生理生化鉴定结果Table 1 Physiological and biochemical properties of the LAB

参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[17],36株乳酸菌均为乳杆菌属,R1、R6、R8与植物乳杆菌(L.plantarum)特征一致,R3与微小乳杆菌(L.minor)生化反应相似度极高,R4、R33与鸟乳杆菌不解棉籽糖亚种乳杆菌(L.aviariussubsp.araffinosus)特征一致,R7、R35与鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)特征一致,R10、R15、R30与马乳酒样乳杆菌(L.kefiranofaciens)特征一致,R11、R13、R16、R18、R19、R20、R22、R24、R25、R27、R36与卷曲乳杆菌(L.crispatus)特征一致,R17、R21、R23、R28、R31、R34与嗜酸乳杆菌(L.acidlophilus)特征一致。菌株R2、R5、R9、R12、R14、R26、R29、R32无法确定,其中R2、R5、R9三者特征一致,R12与R32特征一致,R14、R29、R26三者不相同,这36株菌中唯独R26不能使马尿酸钠产生沉淀。这36株菌均为乳杆菌属,与毛青钟等[19]的报道相符合。

2.3 乳酸菌抑菌活性

以G+菌株蜡样芽孢杆菌、G-菌株大肠杆菌为指示菌,36株乳酸菌的抑菌活性见表2。从表2可知,36株乳酸菌均对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌有抑制作用,以蜡样芽孢杆菌为指示菌时,抑菌圈清晰,抑菌圈最大的菌株为R2,其直径为18.14 mm,抑菌圈最小的菌株为R26,其直径为13.72 mm;以大肠杆菌为指示菌时,抑菌圈不是很明显,边缘不清晰,抑菌圈最大的菌株为R3,其直径为16.50 mm,抑菌圈最小的菌株为R15,其直径为10.88 mm。

表2 乳酸菌抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of the LAB

从目前报道来看,大部分乳酸菌所产抑菌物质只对G+或G-有抑制效果,少部分乳酸菌如乳酸菌SD-22[20]、乳酸菌Y13、X29和X30[21]、植物乳杆菌HLJ-174[22]等既抑制G+,也抑制G-,乳酸菌SD-22还对部分真菌有抑制作用[20]。本研究分离出的36株乳酸菌既对G+蜡样芽孢杆菌有抑制作用,也对G-大肠杆菌未有抑制作用,说明这些乳酸菌生理特征与现有报道有区别;另外,这可能就是浸米时间长酿得的酒,入坛后能够久藏不坏的原因之一。

图3 乳酸菌对大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of the LABon B.cereus and E. coli注:A:蜡样芽孢杆菌为指示菌;B:大肠杆菌为指示菌。

2.4 有机酸干扰的排除

目前发现乳酸菌的抑菌性主要依赖于其产生的代谢产物,这些物质主要有有机酸如乳酸、乙酸、苹果酸等,蛋白或小肽如reuterin和bacteriocins[23-24],以及新型抑菌物质如苯乳酸、4-羟基苯乳酸[25-26]等,为了验证该抑菌物质是乳酸、乙酸、盐酸,还是有机酸外的某类物质,用乳酸、乙酸和盐酸调节MRS液体培养基至pH5.0的抑菌效果见表3。

表3 三种有机酸在pH5.0时的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of threekinds of organic acids at pH5.0

从表3可见,乳酸、乙酸和盐酸调节MRS液体培养基至pH5.0时,对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌均无抑菌活性;该结果与王伟[16]的研究报道相似。这说明乳酸菌发酵产生的抑菌物质并非是乳酸、乙酸和盐酸等有机酸,而是由其它类型的抑菌物质组成的。

3 结论

本实验在黄酒米浆水中分离得到36株对蜡样芽孢杆菌和大肠杆菌同时有抑菌作用的乳杆菌,初步判断为植物乳杆菌、微小乳杆菌、鸟乳杆菌不解棉籽糖亚种乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、卷曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌等。这36株乳杆菌产生的抑菌物质非乳酸菌发酵产生的乳酸、乙酸和盐酸。黄酒米浆水中乳酸菌资源丰富,但是其生理特性、发挥的功能及代谢通路仍不清楚,本研究仅筛选了具有抑制细菌生长的乳酸菌,为黄酒米浆水中抑菌物质的研究提供了思路,但是对乳酸菌的特性、抑菌物质的类型等仍需深入研究,因为其不仅影响黄酒的品质,而且可能在食品保鲜、生物医药等领域发挥更大的作用。