姜黄素对衰老大鼠内皮祖细胞功能的影响

宰青青，叶 兰，秦 臻，潘 婷

（1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2贵州医科大学基础医学院，贵州 贵阳 550025）

衰老是复杂多变的一个过程，也是生物体发展的必定趋向。构成生物体的单位是细胞，所以细胞的衰老是造成整个机体衰老的前提。EPCs是能分化成内皮细胞的干细胞，有非常强的增殖能力，分布在骨髓和外周血等组织里，可以促进损伤内皮的修复和参与新生血管的生成[1]。遗传因素和机体自身环境都会对其功能和增殖分化能力造成影响。研究表明伴随机体的衰老，EPCs会表现出动员不够、数目变少、增殖分化能力显著下降等老化的现象，此外，衰老机体自身的危险因素也会加快EPCs的衰老，使其难以发挥对血管内皮的更新和修复作用[2-3]。姜黄素是一种抗衰老的中药且具有安全有效特点，通过观察实验中姜黄素对衰老大鼠骨髓源性EPCs功能影响，探讨姜黄素对衰老EPCs机制可能的结果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠50只，体重在210～270g，本次实验大鼠来源于贵州医科大学实验动物中心标准饲料饲养的大鼠，合格证号：SCXK（黔）2018-0001。

1.2 主要试剂和仪器

姜黄素（Sigma公司）；D-半乳糖（Sigma公司）；M199培养液（HyClone公司）；胎牛血清（PAA公司）；D i l 标记的乙酰化低密度脂蛋白（奕源生物科技有限公司）；FITC标记的荆豆凝集素1（Sigma公司）；transwell小室（Corning公司）；CO2培养箱（Thermo Forma公司）；酶标仪（Bio-tek公司）；荧光显微镜（OLYMPUS公司）。

1.3 动物分组处理

按体重将SD雄性大鼠随机分成5组，即对照组、模型组和姜黄素高、中、低剂量组各10只。参照文献方法造模[4]，4个实验组天天腹腔注射D-半乳糖100 mg/kg，持续60天，注射的同时干预给药。姜黄素高、中、低剂量组每天予以400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg姜黄素进行灌胃，同时另外两组灌胃等量的生理盐水，持续60天。

1.4 EPCs的分离、培养及鉴定[5]

脱颈处死大鼠后，无菌环境下进行股骨和胫骨的分离，用M199培养液将细胞冲至离心管中，对200目细胞进行筛滤，1000 r/min×5 min离心后重悬；将重悬液按1：1慢慢加到大鼠骨髓淋巴细胞分离液的上面，2000 r/min×20 min离心，小心的用吸管吸出位于第二层的单个核细胞层，然后用M199培养液1500 r/min×5 min离心洗涤两次。用M199全培养液重悬后计数，以5×106cells/mL的接种在24孔板上，各组细胞分别置于37℃、5% CO2培养箱中，3d换液1次。

将培养至第7 d的贴壁细胞弃上清，先加入含2.4 mg/L Dil-ac-LDL的M199培养液，1h后固定于4%多聚甲醛中，随后再加含有10mg/L FITC-UEA-1的M199培养液，置培养箱中作用1h，经过PBS漂洗，避光封片处理后。 用倒置荧光显微镜观察制作好的片子，吞噬ac-LDL的细胞发红光，结合UEA-1的细胞发绿光，同时吞噬ac-LDL及结合UEA-1的细胞为正在分化的大鼠EPCs。

1.5 EPCs功能的检测

1.5.1 EPCs细胞集落形成能力检测

培养至第7 d，镜下随机选取5个培养孔计算各组EPCs集落形成的数量。

1.5.2 EPCs增殖力检测

收集各组培养至第7d的细胞，并进行计数，将等量的EPCs接种于96孔板上，各组设复孔5个，细胞贴壁后加20μL5%的MTT，持续培养4h后弃上清，加150μL的二甲基亚砜充分震荡，放入酶标仪选用490nm测其吸光值，实验重复3次。

1.5.3 EPCs迁移力检测

将之前收集好的各组等量细胞液加在transwell小室的上室，下室是含有50 mg/L VEGF的培养液，1 d后用PBS淋洗，下室中加1mL4%多聚甲醛进行固定30 min，适当吹干后，Geimsa染色30 min，用PBS淋洗，取出滤膜封片，随机选5个视野进行计数，实验重复3次。

1.5.4 EPCs成小管力检测

按照试剂盒操作，将胶液和稀释液过夜冻融，900 μL胶液中加入100 μL稀释液混匀加入96孔板，每孔50 μL，孵育l h凝固成胶；将各组细胞以5×103 cell/孔接种于胶上；培养1 d后，镜下观察小管生成状况，随机选5个视野进行计数，实验重复3次。

1.6 统计学处理方法

用SPSS 17.0软件处理，用（±s)表示计量资料，当方差齐性时，用单因素方差进行组间对比分析，当方差不齐时，用Kruskal-Wallis秩和检验，P＜0.05表示差异具有显著性，P＜0.01表示差异具有极显著性。

2 结 果

2.1 EPCs 的鉴定（图1）

贴壁细胞分别经过Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1处理，用荧光显微镜观察，同时摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的细胞为所需的EPCs。

2.2 姜黄素对D-半乳糖所致衰老大鼠的骨髓EPCs功能的影响（见表1）

与对照组对比，模型组骨髓EPCs的功能严重受损（P＜0.05）；与模型组对比，姜黄素高、中两个组均可提高EPCs的各项能力（P＜0.05，P＜0.01）。该结果显示姜黄素可明显改进衰老大鼠受损EPCs的功能，延缓细胞衰老。

图1 EPCs的鉴定（×200）

表1 姜黄素对D-半乳糖所致衰老大鼠的EPCs功能的影响（±s，n=3）

表1 姜黄素对D-半乳糖所致衰老大鼠的EPCs功能的影响（±s，n=3）

注：和对照组作比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；和模型组作比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 集落数(个) 增殖力(OD) 迁移力(cells×200) 成小管力 (cells×200)对照组 2.4±1.14* 0.31±0.02** 55.6±5.13** 36.8±7.26**模型组 0.6±0.55△ 0.22±0.04△△ 35.4±4.39△△ 22.4±3.78△△姜黄素高剂量组 2.2±1.48* 0.30±0.04** 52.4±4.39** 36.2±6.26**姜黄素中剂量组 1.8±1.30 0.28±0.03* 44.8±4.44** 31.8±4.82*姜黄素低剂量组 0.8±0.84 0.26±0.02 40.4±5.59 25.4±4.04

3 讨 论

随着经济的发展和人口的老龄化，动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、癌症等与衰老相关疾病的发病率和死亡率日益增高，如何安全有效地延缓衰老已变成人们关注的焦点，因而抗衰老药物及其机制的研究已变成目前研究的热点。现代药理学研究显示[6]姜黄素有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血糖等作用，对衰老的各个方面都有一定的抑制作用。本实验通过在整体水平上观察姜黄素对EPCs衰老的干预效果，表明姜黄素可明显增进衰老EPCs的数目并改进其功能，促进衰老EPCs的活性，有效延缓细胞的老化进程，但其具体的信号通路还需进一步深入研究。