miR-374b 与Myf6 在绵羊不同生长时期骨骼肌中表达规律的研究

李 倩，李兰兰，栾兆进，王国义，柳 楠，贺建宁*

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2.包头市农业科学研究所，内蒙古包头 014013；3.赤峰市敖汉种羊场，内蒙古赤峰 024300）

骨骼肌发育是一个复杂的生物学过程，主要包括骨骼肌细胞增殖、分化、肌管融合、肌纤维肥大等，这一系列过程会受到一些调控因子的调节，除广泛所知的生肌调节因子家族（MRFs）和肌细胞增强因子家族（MEF2）起调控作用外，已经有越来越多的miRNA被发现是另一种重要的调节因子。因此，研究调控绵羊肌肉生长发育的分子机制，进而为肉羊分子育种提供一定的理论依据。

miRNA 的表达有着组织特异性，并且它们中的大多数仅在特定组织和发育阶段表达并起作用[1]。一组称为MyomiRs 的miRNAs 在心肌或骨骼肌中高度表达，主要包括miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208、miR-208b、miR-486 及miR-499[2-4]。近年来，在生物科学方面关于miRNAs 对动物生理调控的研究十分火热。同样也有大量的研究表明miRNAs 在肌肉发育方面有着强大的调控作用。Dicer（miRNAs 成熟所必需的酶）的缺失引起小鼠肌肉发育异常而死亡[5]。miR-140-3p 同样对骨骼肌细胞具有调控作用[6]；miR-151-3p 通过调控ATP2a2 的表达量来影响骨骼肌细胞的形成[7]。多种miRNAs 通过与MRFs 的相互作用在成肌细胞的增殖和分化中起到至关重要的作用[8]。有研究发现miR-374b 特异性结合Myf6的3' 非翻译区（UTR），miR-374b 可直接靶向Myf6并负调节肌细胞生成，在mRNA 和蛋白水平下调Myf6基因的表达[9]。

迄今对miR-374b 的研究多集中在对癌细胞和小鼠成肌细胞增殖分化的影响，但是否对绵羊等家畜骨骼肌生长发育有影响鲜有报道。因此，本实验检测绵羊不同发育生长阶段miR-374b 和Myf6基因的表达规律及其与单根肌纤维横截面积变化规律的关系，探究出miR-374b 是否会通过其靶标基因Myf6影响绵羊的骨骼肌生长发育，进而为肉羊分子育种提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 实验羊均来自内蒙古赤峰敖汉种羊场，选取同一饲养管理条件下，健康的胎龄90 d、胎龄120 d、初生期、出生后60 d 南非肉用美利奴羊各4 只，采取背最长肌、股二头肌组织样品置于无RNA 酶的冻存管中，迅速投入液氮，带回实验室于-80℃冰箱冻存，用于总RNA 的提取；一部分背最长肌、股二头肌保存于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色试验。

1.2 主要试剂 iTaqUniwersal SYBR Green Supermix5 mL购自秀佰瑞生物技术有限公司；95%乙醇、无水乙醇、二甲苯均购自天津化学试剂有限公司；石蜡购自上海华灵康复器械厂；伊红购自国药化学集团试剂有限公司；苏木素购自上海新中化学厂。

1.3 组织总RNA 提取及cDNA 合成 采用Trizol 法进行总RNA 的提取，按照试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，蛋白核酸分析仪进行cDNA 浓度及其OD 值检测。

1.4 实时荧光定量 荧光定量检测在伯乐荧光定量PCR仪CFXConnect中进行，Myf6与GAPDH反应程序：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 个循环；mir-374b 和5sRNA 反应程序：95℃预变性3 min；PCR 反应95℃12 s，62℃ 40 s，共40 个循环，62℃时采集荧光信息。

1.5 HE 染色 ①将已经切好的切片放至染色架上；②染色：二甲苯(Ⅰ)，8 min →二甲苯(Ⅱ)，8 min →无水乙醇(Ⅰ)，5 min →无水乙醇(Ⅱ)，5 min →95%酒精(Ⅰ)，3 min →95% 酒精(Ⅱ)，3 min →80% 酒精，2 min →70% 酒精，2 min →50% 酒精，2 min →蒸馏水，2 min →苏木精，8 min →自来水，2 min →蒸馏水，2 min →1%酒精盐酸，3～5 s →自来水蓝化，15 min →蒸馏水，2 min →50%酒精，2 min →70%酒精，2 min →80% 酒精，2 min →伊 红，2 min →95% 酒精(Ⅰ)，3 min →95%酒精(Ⅱ)，5 min →无水乙醇(Ⅰ)，5 min →无水乙醇(Ⅱ)，5 min →二甲苯(Ⅰ)，5 min →二甲苯(Ⅱ)，5 min；③封片：于载玻片的标本上滴加中性树胶并用盖玻片覆盖，于阴凉通风处晾干。

1.6 统计分析 使用SPASS 20.0 软件对miR-374b 和Myf6基因相对表达量采用2-ΔΔCt计算进行单因素方差分析，结果用平均值± 标准误表示。使用SPASS 17.0 软件将4 个不同生长时期Myf6、mir-374b 基因的mRNA表达量和单根肌纤维横截面积变化进行相关性Person检验。P＞0.05 表示差异不显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 qRT-PCR 扩增 如图1 所示，miR-374b、Myf6和内参基因5sRNA、GAPDH的熔解曲线峰值图只有一个特异性高峰，无其他杂峰，表明引物具有较高特异性，可用来进行下一步实验。

2.2 miR-374b、Myf6基因在不同时期背最长肌中的表达规律 由表1 可知，背最长肌中miR-374b 和Myf6基因的mRNA 表达量都在胎龄90 d 时最高，且极显著高于其他3 个时期。miR-374b 在出生后60 d 表达量最低，miR-374b 在这4 个不同生长时期mRNA 相对表达量总体呈下降趋势；Myf6在初生期表达量最低，由初生至出生后60 d 呈上升趋势。

由表2 可知，miR-374b 的表达量在股二头肌中胎龄120 d 时最高且极显著高于其他3 个时期，出生后60 d 表达量最低；Myf6胎龄90 d 表达量最高且极显著高于其他3 个时期，初生期表达量低。miR-374b 和Myf6基因在4 个时期股二头肌中的表达量呈相反趋势。

2.4 不同生长时期肌肉组织切片结果 背最长肌与肱二头肌在不同生长时期的肌肉组织切片结果如图2 所示。

2.5 不同时期单根肌纤维横截面积 由图3 可知，背最长肌和股二头肌单根肌纤维横截面积随着月龄的增加均呈极显著增长；股二头肌单根肌纤维横截面积总大于背最长肌。

2.6 miR-374b、Myf6表达量与单根肌纤维横截面积的相关性分析 由表3 可知，在背最长肌中miR-374b 表达量与单根肌纤维横截面积变化呈极显著负相关（r=-0.941，P＜0.01），Myf6表达量与单根肌纤维横截面积变化呈显著负相关（r=-0.625，P＜0.05）；在股二头肌中miR-374b 表达量与单根肌纤维横截面积变化呈显著负相关（r=-0.677，P＜0.05）；Myf6表达量与单根肌纤维横截面积变化无显著性相关关系。

3 讨 论

表1 miR-374b、Myf6 在不同时期背最长肌中mRNA 相对表达量

表2 miR-374b、Myf6 基因在不同时期股二头肌中mRNA 相对表达量

表3 背最长肌中miR-374b、Myf6 表达量与单根肌纤维横截面积相关性分析

在肌肉发育的全部过程中，从胚胎期肌祖细胞的迁移、增殖、分化及肌纤维的形成，到动物在出生后肌肉组织成熟及功能越来越完善，生肌调节因子（MRFs）家族都有参与[10]。Myf6 是仅有的一个存在于成熟神经节中的MRFs 家族中的成员[11]，亦位于其他生肌bHLH 因子的下游，在肌纤维的形成和肌肉表型的维持中起作用。

miRNAs 是关于肌纤维以及骨骼肌生长发育的重要调控因子，已有miR-1、miR-133 和miR-206 等micro RNA 被证实参与调控成肌细胞的增殖分化。有研究显示，将含有miR-1、miR-133 和miR-206 质粒的混合液注射到大鼠的胫骨前肌损伤的地方，会使得骨骼肌再生能力增强，受到损后的第3 天和第7 天MyoD1、MyoG和Pax7表达水平上升[12]，就会使得肌肉受到损伤后得到一定的修复。此外，对骨骼肌的再生有重要作用的还有一些其他的非肌源性microRNA。miR-431 会通过靶向Smad4使老化的骨骼肌再生[13]。但也有一些microRNA 会对骨骼肌生长发育产生抑制作用，miR-128 能够使得Sp1 的表达受到抑制，从而调控牛成肌细胞的增殖[14]；miR-128 可以靶向肌肉生长抑制素（MSTN），使骨骼肌细胞增殖受到抑制从而促进其分化[15]。还有研究证明在小鼠中miR-374b 可直接靶定Myf6基因以调控成肌细胞的分化，而miR-374b在绵羊出生前及出生后的不同骨骼肌发育时期与Myf6基因的表达关系还未有研究。本研究结果表明，miR-374b 与Myf6基因在南非肉用美利奴羊的4 个不同发育生长阶段的背最长肌中mRNA 表达变化趋势基本一致，都呈下降趋势，但是在出生后60 d 时miR-374b 基因mRNA 表达量持续下降，Myf6基因表达量呈上升趋势；在股二头肌中miR-374b mRNA 表达量先上升后下降，Myf6基因mRNA 表达量先下降后上升，2 个基因mRNA 表达变化趋势相反，Myf6western blot 蛋白实验结果与Myf6基因Q-PCR 实验结果基本一致。随着绵羊日龄的增加、体重体长增加、肌纤维增粗，miR-374b 的表达量总体呈下降趋势。该结果说明miR-374b对Myf6基因的负调控作用在这4 个时期主要表现在股二头肌中，推测miR-374b 在绵羊不同部位生长发育的前后期所发挥的生物学功能不同，miR-374b 对绵羊骨骼肌生长发育具有一定的负调控作用。

骨骼肌是动物体的核心成分，一些产肉量高的动物骨骼肌约占动物体的一半。骨骼肌主要是由肌纤维组成，各肌纤维类型所占的比例决定了动物的肉产量和肉质风味[16-17]。一般来说，肌肉纤维数量能够在哺乳动物胎儿发育阶段达到最大值，出生之后肌纤维的数量通常不会改变，肌肉的生长主要取决于肌纤维直径的增长和肌纤维类型的相互转化[18]。骨骼肌的生长和肥大与许多因素有关，包括动物饮食和外部环境。骨骼肌的发育是一个非常复杂的生物过程，受许多遗传因素的调节，如肌源性调节因子、原代细胞生成素和肌肉生长抑制素[19]。本实验结果表明，南非肉用美利奴羊的4 个不同发育生长阶段的背最长肌和股二头肌单根肌纤维横截面积随着月龄的增长而增大，肌纤维横截面积均表现为股二头肌＞背最长肌；在背最长肌及股二头肌中miR-374b 表达量与单根肌纤维横截面积变化分别呈极显著和显著负相关；而Myf6表达量在背最长肌中与单根肌纤维横截面积变化显著性负相关，在股二头肌中与单根肌纤维横截面积变化无显著相关关系。马志远[20]研究也发现，过表达miR-374b 可使快肌纤维和慢肌纤维均受到抑制，由此推测miR-374b 负向调控肌纤维生长。

4 结 论

由本实验结果推测，miR-374b 在4 个生长时期（胎龄90 d、胎龄120 d、初生期、出生后60 d）主要在股二头肌对Myf6基因起负调控作用。利用miR-374b、Myf6在绵羊不同时期的表达规律及其与单根肌纤维横截面积的关联分析，得出miR-374b 可能是负向调控肌纤维生长。