黄单胞杆菌侵染后不同品种核桃抗病性相关生理指标的测定

李 亚, 韩 颖, 杨 斌, 赵 宁,

(1.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；2.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224)

云南省是我国核桃生产大省，核桃产业是促进云南地区发展的主导产业[1].截至2018年底，云南省核桃产量已达116万t，综合产值达318亿元，其产值和产量均居世界前列[2].云南省因其丰富的地势条件具有多种核桃栽培品种，包括漾濞大泡核桃、三台核桃、细香核桃等为主的泡核桃品种，娘青核桃、桐子果等为主的夹绵核桃，以及云新系列杂交选育品种[3-4].

核桃黄单胞杆菌(Xanthomonasarboricolapv. Juglandis)是引起核桃细菌性黑斑病的主要病原菌，大量研究表明，植物的品种抗病性与植物的生理生化指标变化有关[5-8].董玉峰等[9]发现感病品种的杨树感染溃疡病后，其体内单宁含量比抗病品种低；刘兰玉[10]发现感病品种的板栗感染板栗膏药病时，其糖含量比抗性品种高.部分生理指标已明确可以作为抗性评价指标，如可溶性糖可用于评价由腐皮镰刀菌引起的核桃根腐病抗病性[11]；单宁可以作为油茶炭疽病抗病性评价的指标[12]；郑磊等[13]发现杧果受细菌性角斑病菌侵染的短期内，其体内可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛等生理指标会发生显著变化以诱导植物体产生抗性抵御胁迫环境.由此可见，植物体内的一些生理生化指标与植物抗性有一定的关系.

研究寄主植物受病原菌侵染后的生理生化变化，对揭示病原菌致病机制、植物抗性生理基础有着重要意义.已有研究表明，核桃接种黄单胞杆菌后，体内抗性酶和酚类化合物的变化可用于判定品种与黑斑病易感性的关系[14-15].但是测试抗性酶和酚类化合物的体系不仅复杂，而且所需仪器较为昂贵，一线生产单位难以实现.因此，本研究选取大泡核桃、三台核桃、扎343、云新云林4个核桃品种为材料，研究接种核桃黄单胞杆菌后各核桃品种的发病情况及可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和单宁含量的变化，分析不同品种核桃生理指标变化与抗性的相关性，旨在建立一种简单易操作的核桃对黑斑病抗性的鉴定方法，为早期鉴定核桃品种的抗病性提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：核桃黄单胞杆菌X.boricolapv. juglandis，由西南林业大学生物化学教研室分离纯化并保存，菌株号QLDAfr-119.

供试植株：大泡核桃、三台核桃、云新云林、扎343嫁接苗各20棵，由云南省大理白族自治州林业科学研究所核桃种质资源库提供.

1.2 菌株制备及侵染

菌悬液制备：将活化的核桃黄单胞杆菌接种于NA培养基，30 ℃培养5～7 d后挑取适量菌体融于无菌水中，配制成1×107cfu·mL-1的菌体悬浮液待用.

病原菌的接种：选取健康无病害、长势相同的2 a生大泡核桃、三台核桃、云新云林、扎343核桃嫁接苗各20棵，选择同一部位枝条上的叶片，用灭菌接种针刺相同数量、相同面积的针孔，其中10棵在叶片针刺部位覆盖喷洒了核桃黄单胞杆菌菌悬液的无菌棉球，另外10棵在针刺部位覆盖喷洒了无菌水的无菌棉球作为对照，保湿处理24 h后取下棉球.每天观察记录叶片发病情况及病斑面积，并在接种后的第0、5、10、15、20、25、30 d采摘各处理组及对照组叶片测其生理生化指标，做3个生物学重复.

1.3 抗病性评价方法

根据接种病原菌后统计的不同时期的叶片病斑面积和数量，计算出相应的病情指数.

其中病害分级标准参照贺占雪等[16]的分级标准，在其基础上适当改进，根据病斑面积占比将病级分成4级：0级、无病症；1级、病斑面积<5%，2级、5%<病斑面积占叶面积≤25%；3级、25%<病斑面积占叶面积≤50%；4级、病斑面积>50%.

以病情指数为基础，对不同品种的核桃进行抗病性评价分析.参照王瑜等[17]抗病性等级划分标准并结合病情指数将抗病性等级分为4类：抗病、病情指数<5；中抗、5≤病情指数≤15；中感、15<病情指数≤25；感病、病情指数>25.

1.4 生理生化指标测定

可溶性糖含量的测定参照赵轶鹏等[18]采用的蒽酮比色法；可溶性蛋白含量的测定参考赵英永等[19]采用的考马斯亮蓝法；脯氨酸含量的测定参考张瑛等[20]采用的磺基水杨酸提取核桃嫩叶中游离脯氨酸的方法；单宁含量测定参考玄立春等[21]采用的钨酸钠比色法.

1.5 数据分析处理方法

利用Excel 2010进行数据处理，利用SPSS 22.0使用LSD多重比较方法进行显著性检验并利用Pearson相关系数进行相关性分析.

2 结果与分析

2.1 4个核桃品种接种核桃黄单胞杆菌后的抗病性

由表1可得，4个品种核桃接种核桃黄单胞杆菌后发病情况差异显著.大泡核桃和三台核桃在接种20 d后才出现病斑，病级为1级，表现为抗病品种；云新云林和扎343在接种10 d后就有明显的病斑出现，且扎343发病程度较高，30 d后病斑面积达到98.78 mm2.接种30 d时，云新云林和扎343的发病率分别为50%和60%，病情指数均大于25，均表现为感病品种.

表1 4个品种核桃接种核桃黄单胞杆菌后抗病等级

2.2 核桃黄单胞杆菌对核桃可溶性糖含量的影响

由图1可知，4个品种的核桃在接种前可溶性糖含量差异不显著(P>0.05)，接种病原菌后可溶性糖含量均呈上升趋势，第20 d到达峰值后开始下降.受感染叶片的可溶性糖含量均高于对照组，抗性品种的可溶性糖含量持续低于感病品种，即扎343>云新云林>大泡核桃>三台核桃.受病原菌侵染20 d后，感病品种的可溶性糖含量较对照组平均升高了16.85 mg·g-1，而抗性品种平均增量仅为2.3 mg·g-1.接种病原菌30 d后，抗性品种的可溶性糖含量比感病品种平均低了45.92%.扎343和三台核桃在试验期内均存在极显著差异(P<0.01).

2.3 核桃黄单胞杆菌对核桃可溶性蛋白含量的影响

由图2可知，4个品种的核桃在接种前可溶性蛋白含量存在显著差异(P<0.05)，扎343及其对照显著高于其他处理组；接种病原菌后可溶性蛋白含量均呈下降趋势，10 d后开始缓慢回升，各对照组的可溶性蛋白含量低于处理组；接种30 d后抗病品种的可溶性蛋白含量比感病品种平均低了63.40%，其含量差异是抗性品种的1.73倍.扎343的处理组和对照组在试验期内与其他3个品种间差异显著(P<0.05)，可溶性蛋白含量：扎343>云新云林>大泡核桃>三台核桃.

2.4 核桃黄单胞杆菌对核桃脯氨酸含量的影响

由图3可得，抗性品种的脯氨酸含量显著高于感病品种(P<0.05)，在接种病原菌20 d后，含量差距高达242.02 μg·g-1，三台核桃的脯氨酸含量与感病品种间差异极显著(P<0.01)；接种30 d后感病品种的脯氨酸含量比抗病品种平均少了67.33%，含量差异是感病品种的2.06倍.整个试验期内，不同品种核桃叶片内脯氨酸含量变化均呈下降—上升—下降的趋势，且对照组的脯氨酸含量始终低于处理组.

2.5 核桃黄单胞杆菌对核桃单宁含量的影响

由图4可得，接种病原菌之后所有品种核桃的单宁含量都有不同程度的上升，除扎343及其对照组，其他品种核桃的单宁含量在接种10 d后达到峰值，其含量为三台核桃>大泡核桃>云新云林>扎343；整个试验期内，所有品种核桃单宁含量的变化趋势一致.抗性品种的单宁含量始终高于感病品种，接种30 d后感病品种比抗病品种单宁含量少了52.44%，含量差异是感病品种的1.1倍，感病和抗性品种差异显著(P<0.05).

2.6 核桃品种抗性与生理生化指标的相关性

由表2可得，不同品种核桃的抗性和可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、单宁含量间存在极显著相关，可溶性糖和可溶性蛋白含量与品种抗性间存在极显著的负相关(P<0.01)；脯氨酸和单宁含量与品种抗性间存在极显著正相关(P<0.01)；除可溶性糖含量与接种时间存在显著正相关外(P<0.05)，其他生理指标与接种时间之间没有相关性.另外，核桃黄单胞杆菌的接种时间与病情指数间为极显著正相关，而品种抗性与病情指数间为极显著负相关关系.

表2 4个核桃品种处理时间、生理指标和品种抗性的相关性1)

1)*P<0.05；**P<0.01.

3 讨论

本研究中不同品种核桃对黄单胞杆菌抗性与可溶性糖含量成负相关，变化趋势与不同油菜品种对菌核病抗病性差异及关系基本一致[22].可溶性糖在植物体内主要参与呼吸代谢以及为保护性物质合成提供原料[23].受病原菌侵染时，植物细胞壁分解，可溶性糖含量升高，因此本研究中4个品种的核桃在受到病原菌侵染后，植物体内可溶性糖含量都有不同程度的升高.其中抗性品种可溶性糖含量比感病品种低了45.92%(图1)，是由于感病品种的受损更严重，细胞壁分解程度更高.受病原菌侵染20 d后，可溶性糖含量开始下降，这是由于植物体内的可溶性糖被病原菌利用，或者被机体的呼吸作用消耗.

可溶性蛋白是参与机体渗透调节活动的重要营养物质，常作为评价品种抗性的指标[24].本研究中4个品种的核桃受到病原菌侵染后，叶片可溶性蛋白含量均呈下降趋势，与花生接种疮痂病菌后可溶性蛋白与品种抗性间的负相关关系一致[25].植物通过降解可溶性蛋白以参与抗病物质的合成，增强抗病性.受核桃黄单胞杆菌侵染20 d后，感病品种的可溶性蛋白含量开始升高，抗性品种的可溶性蛋白含量比感病品种少了63.4%(图2)，这是由于病原菌的侵染促使了植物的氮代谢，为病原菌生长提供能量，使得病原菌更容易入侵[22]，而抗病品种能够继续降解可溶性蛋白以保持抗性.

本研究中4个品种的核桃受到病原菌侵染后，叶片的脯氨酸含量有不同程度的升高，与核桃抗性呈正相关，感病品种的脯氨酸含量比抗性品种少了67.33%(图3)，与大豆抗腐霉根腐病时脯氨酸含量显著升高的趋势一致[26].植物体受病原菌侵染时，抗性品种能够快速产生脯氨酸以减轻渗透失衡引起的各类酶蛋白变性，通过调节渗透压来抵御胁迫环境，发挥抗性作用[27].感病品种由于脯氨酸的积累效率较低，体内渗透平衡遭到破坏，使得病原菌更容易入侵.

植物可通过调节次生代谢产物含量来应对逆境胁迫，如提高单宁含量来增强抵抗力[28].本研究中不同品种核桃的抗性与单宁含量呈极显著正相关(P<0.01)，受病原菌侵染后单宁含量显著升高，且感病品种的单宁含量比抗病品种低了52.44%(图4).单宁是一种有效的防护剂，当细胞受损时，植物可以分泌多酚氧化物将单宁氧化成具有毒性的单宁，以抵御病原菌的生长.抗性品种能及时分泌大量单宁来抵御病原菌，而感病品种合成单宁的效率较低，不能及时抑制病原菌的生长[29-30].

不同抗性品种核桃树接种黄单胞杆菌后，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和单宁的含量较对照组均有不同程度的增加，抗性品种体内的脯氨酸和单宁含量在接种病原菌前后都维持在一个较高的水平，而感病品种体内的脯氨酸和单宁含量较低，单宁和脯氨酸含量与品种抗性间存在积极的正相关关系.感病品种接种病原菌前后可溶性糖和可溶性蛋白含量都高于抗性品种，同一指标抗性品种和感病品种的变化趋势也大致相同，且感病品种扎343的增加幅度显著高于抗性品种，说明病原菌会诱导感病品种中可溶性糖和可溶性蛋白含量的升高更加显著，可溶性糖和可溶性蛋白含量与核桃品种抗性间存在极显著负相关关系.

综上所述，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和单宁的含量可以作为衡量核桃品种抗性的指标，为核桃优良种质资源选育提供理论依据.