1月龄五指山猪与长白猪骨骼肌miRNA转录组比较

孙瑞萍 王峰 晁哲 刘海隆 郑心力 刘圈炜 黄丽丽 邢漫萍 魏立民

摘要：为研究microRNA（miRNA）在五指山猪和长白猪肌肉生长发育中的差异和探究差异miRNA对骨骼肌发育转录后调控的影响，以1月龄的五指山猪和长白猪背最长肌为材料，通过转录组测序和生物信息学分析筛选与骨骼肌发育相关的差异miRNA。结果显示，从2个文库中共鉴定获得318种己知的猪miRNA，五指山猪和长白猪分别鉴定出312个和306个已知miRNA，同时分别发现了83个和88个新的miRNA。获得17个差异显著的miRNA，其中16个miRNA表达上调，1个miRNA表达下调。靶基因预测和生物学功能预测发现17个差异miRNA，共预测到535个靶基因，靶向作用于mTOR信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控的ssc-miR-486，ssc-miR-204，ssc-miR-338和ssc-miR-885-3p 4个 miRNA可能参与骨骼肌生长发育过程。

关键词：五指山猪; 骨骼肌; miRNA;高通量测序

中图分类号：S828.2文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）03-0620-06

Comparative analysis on miRNA transcriptomes of skeletal muscle between one-month-old Wuzhishan pig and Landrace

SUN Rui-ping1，2，WANG Feng1，CHAO Zhe1，2，LIU Hai-long1，2，ZHENG Xin-li1，LIU Quan-wei1，2，HUANG Li-li1，XING Man-ping1，WEI Li-min1，2

（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine， Hainan Academy of Agricultural Science， Haikou 571100， China;2.Hainan Key Lab of Tropical Animal Reproduction & Breeding and Epidemic Disease Research， Haikou 571100， China）

Abstract：To investigate the differences of microRNA （miRNA） in growth and development of skeletal muscle between Wuzhishan pig and Landrace and to explore the effects of differential miRNAs on post-transcriptional regulation of skeletal muscle development， the longissimus dorsi muscles of one-month-old Wuzhishan pig and Landrace were used as materials to screen their differential miRNAs related to skeletal muscle development by transcriptome sequencing and bioinformatics analysis. A total of 318 known porcine miRNAs were identified from two libraries， 312 and 306 known miRNAs were identified in Wuzhishan and Landrace pigs respectively， and 83 and 88 new miRNAs were found at the same time. Seventeen differential miRNAs were obtained， of which 16 miRNAs were up-regulated and one miRNA was down-regulated. A total of 535 target genes were predicted by 17 differential miRNAs， targeting ssc-miR-486， ssc-miR-204， ssc-miR-338 and ssc-miR-885-3p， which were regulated by the mTOR signaling pathway and actin cytoskeleton. The four miRNAs can participate in the growth and development of skeletal muscle.

Key words：Wuzhishan pig;skeletal muscle;microRNA;high-throughput sequencing

猪是重要的经济动物之一，其骨骼肌发育与肉类生产和肉质形成密切相关，其肌肉生长发育的机理一直为猪遗传改良研究的热点。五指山猪具有体型矮小、生长速度慢、瘦肉率低但肉质优良等特征，而国外引进的长白猪具有体型高大、生长速度快、肉质差但瘦肉率高等特点，这2个品种之间存在极端显著的性状差异，是研究品种差异的理想模型。

小分子RNA（microRNA，miRNA）是生物体内一类重要的特殊分子，通过靶向mRNA的3′端来调控靶基因的表达，它的发现为研究生物的基因表达调控机制提供了新的视角。研究证实，miRNA在参与猪肌肉发育和生长过程中发挥重要作用，主要包括肌肉细胞的增殖和分化、骨骼肌发育阶段肌纤维增值及转换，以及一些肌肉疾病的發生等。如Sodhi等[1]通过RNA-Seq技术分析了济州岛本地猪（JNP）和来自美国伯克希尔（Berkshire）的猪背最长肌组织的转录组，共发现了39个差异表达基因，它们富集到代谢、免疫反应和蛋白质结合等通路上。陈伟[2]利用 RNA-seq 技术分析 miRNA 在莱芜猪与大白猪中的表达模式，总共筛选出 265 个已知 miRNA，还预测到 94 个新 miRNA，在莱芜猪与大白猪骨骼肌中显著差异表达的有 25 个 miRNA，这些miRNA的靶基因主要被富集到代谢过程等信号通路中。因此研究miRNA在五指山猪和长白猪出生后骨骼肌生长发育和肉质性状差异等方面所起的调控作用及其分子机理具有重要的意义。本研究通过比较分析1月龄五指山猪和长白猪背部骨骼肌生长发育差异miRNA的表达情况，为进一步评估miRNA在猪生长发育中的功能和解析品种间肌肉生长发育差异分子机理提供理论依据。

1材料与方法

1.1样品采集与文库构建

6头1月龄的去势雄性五指山猪（1W）采自海南五指山猪国家级保种场，6头1月龄去势长白猪（1C）购买自海南罗牛山种猪育种有限公司。试验猪屠宰后，分别采集同一部位的背最长肌组织样品于液氮中速冻，带回实验室后转移至-80 ℃冰箱中保存备用。每个样品提取总RNA， 经质量检测合格的每个品种的RNA样品分别混池构建成一个RNA文库用于后期的测序和生物信息学分析。该工作委托深圳市恒创基因科技有限公司完成。

1.2miRNA测序结果的生物信息学分析

miRNA测序得到原始数据（Raw reads），经过数据过滤获得Clean reads。运用Bowtie2软件将 Clean tag比对到猪参考基因组上，统计 Clean tag 的比对率以及在基因组上的分布情况。为确定已知miRNA，将剩余高质量读段与miRbase 21.0（http：//www.mirbase.org）中已知的猪 miRNA 前体/miRNA 成熟序列进行比对。对于比对上的基因组外显子反义链、内含子、基因间区且未注释上任何RNA类型的 Clean tag，结合miRNA的生物学特征，运用 mireap 软件预测新miRNA。

1.3差异miRNA筛选及其靶基因功能分析

对于有 Clean tag 比对上的miRNA，综合前体和成熟体两方面比对情况得到2个试验组猪miRNA 的表达量，然后利用 TPM（Tag per million）进行表达量标准化处理。利用DEGseq和DESeq2软件找出不同样本间差异表达的 miRNA，以差异倍数大于等于2和Q值小于等于0.01作为差异miRNA筛选条件。运用RNAhybrid、miRanda、TargetScan 3种miRNA靶基因预测软件，预测差异miRNA的靶基因。对多个预测软件结果取交集，作为最终的结果。使用KEGG pathway在线软件对靶基因的代谢通路或者信号转导途径进行富集分析。

2结果

2.1五指山猪和长白猪miRNA测序数据

经过对原始数据（Raw data）的过滤筛选和质量评估，共构建了五指山小型猪和长白猪的2个背最长肌miRNA文库。从2个miRNA文库中分别获得21 178 739条和20 725 847条miRNA原始序列，去除低质量Read后，分别获得高质量Clean reads 20 165 360条和19 565 284条，分别占总Read的95.22%和94.4%。能够定位到猪基因组上的特异性Unique序列分别有420 645条和678 594条，分别达到59.47%和61.44%。由图1可知，这些读段序列长度大多数分布在20～23 nt，其中序列长度22 nt所占比例最大，与典型的miRNA长度分布相符。同时我们对已知miRNA 碱基偏向性进行统计，发现五指山猪和长白猪背肌中18～26 nt miRNA首位碱基对U具有强烈的偏好性（图2），与前人的研究结果相同[3]。

2.2已知的猪miRNA的鉴定和统计分析

首先，将测序所得的Clean reads与miRbase21.0中已知的猪miRNA前体序列进行比对，结果显示，从2个文库中共鉴定获得318种己知的猪miRNA，从五指山猪和长白猪中分别鉴定出312个和306个已知miRNA，其中有300个miRNA共表达，这些miRNA分别能被定位到280个和277个已知的猪miRNA前体上。对于比对上的猪基因组但未注释上任何RNA类型的Clean reads，結合miRNA的生物学特征，运用Mireap 预测软件对其进行新miRNA预测分析，在五指山猪中发现了83个新miRNA，在长白猪中发现了88个新miRNA。对miRNA表达量进行统计后发现， ssc-miR-206、ssc-miR-1、ssc-miR-let7家族、ssc-miR-26a、ssc-miR-10a等多个miRNA在1月龄五指山猪和长白猪背肌组织中均高表达（图3）。而作为肌肉特异性ssc-miR-133a-3p在1月龄五指山猪和长白猪背肌组织样品中表达量分别排在第14和20位。这些新发现的miRNA表达量都很低，RPKM>300的miRNA仅有2个，分别为ssc-novel-miR-4和novel-miR-45。

2.3五指山猪和长白猪的差异miRNA

选择差异倍数大于等于2和Q值小于等于0.01作为差异miRNA的选择标准，对五指山猪和长白猪的差异miRNA进行筛选，发现有17个miRNA符合上述条件，其中在五指山猪中表现上调的有16个，仅有1个miRNA （ssc-miR-376a-3p）表现为下调。由于ssc-miR-205在1月龄长白猪种表达量很低，所以差异倍数最大。而表达量较高、差异倍数最大的为ssc-miR-486和ssc-miR-9家族（表1）。

2.4五指山猪和长白猪差异miRNA的功能分析

运用miRNA靶基因预测软件RNAhybrid、miRanda和TargetScan预测五指山猪和长白猪差异miRNA的靶基因，17个差异miRNA共预测到535个靶基因。为深入了解这些基因的生物学功能，对靶基因进行KEGG通路富集分析，共富集到249条生物学通路，其中有18个显著富集通路（P<0.05）。这些显著富集通路中，有已报道的在介导肌肉生长中起重要作用的mTOR信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控（表2）。

3讨论

猪肌肉的生长发育受到许多因素的影响且具有明显的时空特性，时空特异性表达基因间相互调控的信息传递网络是决定猪生长速度和肌肉品质的分子基础。作为一类广泛存在于动、植物体内具有调控功能的非编码RNA，miRNA不仅参与生物机体内的多种生命活动，包括细胞的发育、分化、增殖和凋亡等[4-6]，miRNA对肌肉的形成和生长也是必不可少的[7]。许多研究团队使用高通量测序的方法检测并分析了不同猪种骨骼肌中miRNA在不同生长阶段和不同肌肉组织中的表达情况，不仅在猪的肌肉组织中鉴定出一批新的miRNA，而且发现miRNA的表达具有时序性和组织特异性[8-10]。其中miR-1、miR-133a、miR-206 是研究最多的肌特异性miRNA[11]。miR-206在猪胚胎的不同发育阶段和成年猪中表达丰度非常高，但在肌肉卫星细胞增殖期无表达[12]。miR-1在猪胚胎各个发育阶段中度表达，但在成年猪中高表达，而miR-133在猪的整个胚胎发育阶段以及新生仔猪发育阶段几乎检测不到，但在猪成年期miR-133的表达量适中[13];miR-432在猪胚胎发育阶段表达量最高，出生后随着年龄增长逐渐下降。miR-378、miR-1和 miR-206在骨骼肌和心肌中均高丰度表达[13]。与许多学者的研究结果一致，本研究中1月龄背肌中表达量排名前第1和第2的miRNA分别为mi-206、miR-1，而miR-133a相对于这2个miRNA表达量较低，但在背肌中也属于高表达的miRNA。五指山猪小型猪与长白猪由于遗传背景和环境的差异形成了不同的体型外貌和肌肉特性。

越来越多的miRNA被确认参与猪品种间肌肉发育和肉质差异相关的重要信号调控通路。miR-1和miR-206可以通过靶向Pax7基因影响骨骼肌细胞的增殖，促进肌肉的生长[13];miR-133不仅可以促进肌细胞的增殖，还可以抑制骨骼肌细胞的分化[14]。我们在1月龄五指山猪和长白猪的背肌组织中共发现17个差异显著表达的miRNA，其中只有ssc-miR-376a-3p在五指山猪背肌中表达下调，其余16个miRNA表达均上调，ssc-miR-486 的表达量最高。有报道称[15]，ssc-miR-486在猪肌肉生长发育中发挥重要作用，在1、60、90、180日龄巴马小型猪中的表达量高于长白猪，可能通过靶向p85α、PTEN和FoxOl调控猪骨骼肌IGF1-PI3K/AKT-mTOR信号通路。陈伟[2]利用高通量测序技术分析了莱芜猪与大白猪骨骼肌中差异表达miRNA与差异表达基因，发现ssc-miR-486在生长缓慢的莱芜猪中表达量显著上调，此外，ssc-miR-486可通过靶向AKT信号通路的负调控因子磷酸酶基因（PTEN）影响骨骼肌再生，过表达ssc-miR-486会导致包括PTEN在内的许多靶基因错误调控而使骨骼肌再生异常。在饲粮中持续添加共轭亚油酸（Conjugated linoleic acids，CLA）后腿肌中miR-452的表达量显著上调4倍以上，CLA可能通过影响肌肉中miR-452的表达量调控重要肌肉代谢通路[3]。此外，本研究中发现的差异miR-204和miR-34c也已被报道与骨骼肌的发育相关。Wnt/β-catenin信号通路参与骨骼肌的发育，可以使成肌细胞从增殖状态转变进入分化状态，miR-204通过作用于Wnt/β-catenin信号通路而发挥对骨骼肌发育的调控，在C2C12细胞成肌分化过程中过表达miR-204能明显抑制肌细胞的融合程度和肌管的形成速度[16]。miR-34c可通过YY1基因调控骨骼肌细胞的增殖及分化[17]。本研究中17个差异表达miRNA的535个靶基因共富集到249条生物学通路，其中有18个富集通路差异显著，其中包括在肌肉生长中起重要作用的mTOR信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控。mTOR信号通路在多种疾病中扮演着不可忽视的角色，具有促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬等功能，它能够将感受到的上游信号分子传递给下游的S6K1和4E-BP1 2个效应分子，促进细胞mRNA的转录翻译，进而增加肌肉蛋白质合成。Guertin等[18]的试验结果也已证明mTOR信号通路在动物出生后肌肉发育、肌肉再生、肌细胞分化和肌纤维生长中起重要作用。若特异性敲除肌肉中的mTOR，动物在出生后慢肌纤维生长受阻，从而导致严重的肌肉疾病[19]。在本研究中靶向mTOR信号通路中关键基因的差异miRNA除了与已报道的肌肉生长发育相关的ssc-miR-486和ssc-miR-204外，还有ssc-miR-338和ssc-miR-885-3p，这2个miRNA是否与肌肉生长发育相关，还需进一步的功能驗证。

本研究通过RNA-Seq得到1月龄五指山猪和长白猪背最长肌肉组织中miRNA转录组文库，并比较了两者之间的差异。通过靶基因预测和生物信息学分析发现，很多miRNA（ssc-miR-486、ssc-miR-204、ssc-miR-338和ssc-miR-885-3p）可能影响一些与动物肌肉发育相关的细胞信号通路，尤其是靶向mTOR信号通路和肌动蛋白细胞骨架调控，它们可能部分揭示了1月龄五指山猪和长白猪骨骼肌功能的差异，同时也为进一步研究miRNA调控猪肌肉发育相关的研究提供了基础。

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（责任编辑：张震林）