萝卜硫素对脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用及机制研究

李云鹏,杨玉丹,郭胜存,程 栋,汤 毅

(郑州大学第一附属医院 1.心血管内科、2.肿瘤内科，河南 郑州 450052)

脓毒症(sepsis)是机体对感染反应失调而出现组织灌注不足、低血压及伴有危及生命的器官功能障碍。死亡率高，治疗效果差，是急危重症医学面临的主要临床问题，随着各种医疗技术及治疗方法的进步，脓毒症的病死率已有明显下降，但其对医学界仍然是一个挑战[1]。脓毒症发展过程中的心脏功能障碍(sepsis-induced yocardial dysfunction，SIMD)是严重脓毒症的特征之一，是脓毒症患者死亡增加的主要原因，且心血管功能障碍导致患者生活质量下降，预后不良[2]。此外，脓毒症的发病机制仍不清楚，炎症假说曾被认为是脓毒症的发生发展的主要原因，但抗感染治疗结果却不尽如人意。有研究发现，凋亡和应激均是脓毒症重要的发病机制。所以，探索有效的治疗药物改善脓毒症引起心功能障碍，对于改善脓毒症预后具有重要的临床和社会意义。

萝卜硫素(sulforaphane，SFN)是一种天然存在的异硫氰酸酯衍生物，能够诱导机体分泌II型解毒酶，在不同的研究中证实具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及心血管保护的作用[3-5]。但是，SFN对于脓毒症心肌损伤是否同样具有保护作用，目前尚不可知。本研究拟通过盲肠结扎穿孔建立脓毒症心肌损伤模型，观察SFN对脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂萝卜硫素(Sigma-Aldrich,USA，货号：S6317-5mg)；肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(Biovision，USA)；二氢乙锭(dihydroethidium，DHE)试剂盒(Invitrogen，USA)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平(江苏凯基生物，中国)，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性检测试剂盒(上海碧云天，中国)；原位末端凋亡TUNEL检测试剂盒(Roche，瑞士)；GAPDH内参抗体(Santa Cruz，USA)；Bax、Caspase-3及Bcl-2抗体(Abcam，英国)。

1.2 实验动物健康C57BL/6小鼠，♂,体质量(25±5) g，购买自郑州大学实验动物中心，生产许可证号：SYXK(豫)2019-0002。所有动物实验均严格遵守郑州大学动物伦理保护指导进行。

1.2.1动物模型的构建 参考既往文献[4]，通过盲肠结扎和穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)诱导小鼠脓毒血症。具体操作流程如下：造模前禁食24 h以确保各组小鼠肠内容物一致，使用戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)给予腹腔注射麻醉；用脱毛膏脱除小鼠腹部毛发；沿腹中线切口暴露盲肠，用22号针刺穿刺回盲瓣下方2次，挤压肠内容物后将盲肠还纳回腹腔，缝合。假手术组及单纯SFN组，仅给予盲肠暴露，但不给予盲肠结扎及穿刺，其余步骤同实验组。

1.2.2实验分组及给药方式 将实验小鼠按照实验设计，应用随机数字法平均分为4组，每组10只，(1)假手术组(Sham)：实验小鼠仅给予盲肠暴露，不结扎穿刺，腹腔注射溶剂DMSO (0.5 mg·kg-1)；(2)单纯SFN处理组(SFN)：给予盲肠暴露，不结扎穿刺，腹腔注射溶解于DMSO中的SFN (0.5 mg·kg-1)；(3)盲肠结扎穿孔组(CLP)：实验小鼠给予盲肠结扎穿孔模型制作之后，腹腔注射溶剂DMSO (0.5 mg·kg-1)；(4)盲肠结扎穿孔+SFN处理组(CLP+SFN)：盲肠结扎穿孔模型制作后给予腹腔注射溶解于DMSO中的SFN (0.5 mg·kg-1)。

1.3 心脏功能检测造模24 h后，脱去小鼠胸前毛发，用VEVO 2100(VisualSonics Inc，加拿大)小动物超声仪行M型超声心动图，给予测量及记录左心室舒张末内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)数据，然后再计算左心室短轴缩短率(LVFS)和左心室射血分数(LVEF)，用以评估左心室收缩功能。

1.4 血清CK和LDH水平检测造模24 h后，应用1 mL注射器穿刺左心室采取血液标本，应用离心机以3 000 r·min-1离心10 min后，收集上清液，之后标本放置于-80 ℃冰箱冷冻保存。应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中LDH 和CK 活性。

1.5 心肌组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量检测造模24 h后，用预冷的PBS洗涤心脏，在-80 ℃冷冻后，切成5 mm厚度组织切片。然后，用DHE和DAPI染料对组织切片进行染色。用全自动倒置荧光显微镜(Leica，DMI6000B)拍摄荧光图片，应用软件Image-Pro Plus测定荧光。

1.6 心肌组织SOD活性、GSH-Px活性以及MDA水平检测造模24 h后，迅速取下心脏，用生理盐水(1 ∶9)制备蛋白匀浆。按照说明书分别检测心肌组织中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性以及脂质过氧化产物MDA含量。

1.7 心肌组织原位末端染色法(TUNEL)检测造模24 h后取心脏，放入4%多聚甲醛固定溶液中12 h，石蜡包埋、制备切片，根据TUNEL说明书进行操作，最后在暗室中应用荧光显微镜拍照。计算凋亡指数/%=视野内的绿色荧光(凋亡的细胞核)的数目/蓝色荧光(心肌细胞核)的数目×100%。

1.8 凋亡调节蛋白Bax，Caspase-3和Bcl-2表达测定造模24 h后取心脏，在冰上切取大小质量一致的心肌组织块，然后在研钵内研碎，之后置入EP管，再加入裂解液在冰上进行裂解20 min，于4 ℃条件12 000 r·min-1离心20 min，最后煮沸。蛋白质样品制备后给予电泳、转膜、牛奶封闭后于4 ℃孵育抗Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶500)、Caspase-3(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶8 000)一抗，过夜；继而室温孵育相应二抗(1 ∶8000) 2 h。使用LAS500超灵敏化学发光成像仪检测蛋白质条带，使用ImageJ软件进行定量分析。

2 结果

2.1 SFN处理改善脓毒症小鼠心肌损伤如Fig 1所示，与Sham组相比，CLP组小鼠血清CK和LDH活性均显著升高，表明脓毒症导致心肌损伤(P<0.05)，而给予SFN处理后(CLP+SFN组)，CK和LDH活性则明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与Sham组相比，单纯SFN组的CK和LDH活性变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。

Fig 1 Effect of SFN treatment on CK and LDH activity in sepsis n=6)#P<0.05 vs Sham;*P<0.05 vs CLP.

2.2 SFN处理改善脓毒症小鼠的心脏左心室功能如Tab 1所示，CLP组小鼠与Sham组比较，LVEDD和LVESD显著增高，而LVFS与LVEF显著降低，表明脓毒症导致心腔扩张，心脏功能受损，各组间差异明显(P<0.05)。与CLP组相比，CLP+SFN组可以提高LVEF与LVFS，降低LVEDD和LVESD(P<0.05)。与Sham组相比，单纯SFN组对小鼠心功能无明显影响(P>0.05)。

Tab 1 Effects of SFN treatment on heart function in different n=6)

2.3 SFN对脓毒症小鼠心肌氧化应激反应的影响如Fig 2所示，与Sham组比较，盲肠结扎穿刺造模之后，CLP组小鼠ROS含量与MDA水平明显升高，而SOD和GSH-Px活性明显降低，表明脓毒症致使心肌氧化应激反应增强，各组间差异有显著性(P<0.05)。与CLP组相比，CLP+SFN组可以降低ROS含量与MDA水平，增强SOD活性和GSH-Px活性(P<0.05)。与Sham组相比，单纯SFN组不影响心肌氧化应激反应(P>0.05)。

Fig 2 Effects of SFN on myocardial oxidative #P<0.05 vs Sham;*P<0.05 vs CLP

2.4 SFN抑制脓毒症小鼠心肌组织凋亡与Sham组比较，盲肠结扎穿刺后的CLP组小鼠心肌组织凋亡指数升高。而CLP+SFN组与CLP组相比，心肌凋亡指数则表现为降低(P<0.05)。而单纯SFN组与Sham组比较，两组间凋亡指数则差异无统计学意义(P>0.05)(Fig 3A，3B)。

同时，我们也检测了凋亡相关蛋白的表达水平，进一步验证上述结论。如Fig 3C,3D所示，盲肠结扎穿刺造模后，CLP组小鼠与Sham组比较，心肌组织促凋亡蛋白Bax及Caspase 3表达水平呈现为明显升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2则表现为显著下降，两者差异具有统计学意义(P<0.05)。而CLP+SFN组与CLP组相比，则表现为SFN能减弱促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达水平，并增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，且差异有显著性(P<0.05)。与Sham组相比，单纯SFN组对小鼠心肌组织的相关凋亡蛋白表达水平则无明显影响(P>0.05)。

3 讨论

脓毒症是一种伴有感染的全身多系统疾病，是感染死亡的主要原因，临床常见多发，死亡率可高达25%，若发展为败血症休克并累及心功能障碍，死亡率可高达90%[6-7]。脓毒症发病过程中伴发的心功能障碍是脓毒症多器官功能衰竭的重要特征，常成为促使脓毒症患者死亡的关键因素。而有研究表明，氧化损伤可引起细胞凋亡，导致脓毒症心肌损伤加重[8-9]。因此，寻找能有效减轻脓毒症心肌损伤的药物，是目前我们面临的重要问题。萝卜硫素是一种多功能酶诱导物，在不同的疾病模型研究中，表明其可以有效地预防癌症，具有抗氧化、抗炎和心血管保护作用[3,10]。有研究发现，SFN可以抑制HMGB1的分泌，减弱炎症因子的表达，减轻炎症反应，减轻肺组织损伤，从而提高脓毒症诱导小鼠的存活率[4]。然而SFN能否缓解脓毒症引起的心肌损伤尚未见报道。本课题组前期研究发现，SFN可通过Sirt l信号通路减弱心肌凋亡及内质网应激，保护心肌缺氧复氧损伤[5]。因此，我们提出假设，SFN可以通过抑制氧化应激和凋亡保护脓毒症心肌损伤。在本实验中，我们发现盲肠结扎造模后小鼠心肌损伤标志物CK和LDH明显升高，左室腔扩张，左室射血分数明显下降，心脏收缩功能受损，而应用SFN治疗后，心肌损伤减轻，心功能较模型组明显改善，表明SFN具有减轻心肌损伤和改善心功能的作用。

越来越多的证据表明，氧化应激反应是脓毒症发病的基础，它可以损害血管通透性，恶化心脏功能，同时还能使线粒体功能发生障碍而导致呼吸功能受损，导致脓毒症死亡率增加[11]。线粒体功能障碍可导致ROS生成增加，过量ROS可以进一步导致过氧化反应，其产物MDA能加重心肌损害。ROS含量和MDA水平不仅能反映氧化应激损伤的程度，也是间接评估细胞损伤的指标[12]。在本实验中，CLP组小鼠造模成功后，心肌组织ROS含量和MDA水平明显升高，表明脓毒症影响到线粒体功能障碍，发生氧化应激反应，而进一步损伤心肌和心脏功能；应用SFN处理后,ROS和MDA明显下降，表明氧化应激收到抑制。SOD能够清除氧自由基，通过一系列的生物和化学反应，将过氧化物最后代谢为氧和水，也被作为评估心肌氧化应激和损伤程度的一个指标；GSH-Px也是一种重要的机体抗过氧化物酶，在保护生物体免受氧化应激损伤过程中起重要作用，这类酶能通过复杂的生物化学反应，最终将脂质过氧化物还原成为相应的醇或水[13]。本实验中，CLP组小鼠造模后SOD和GSH-Px明显下降，表明脓毒症小鼠的抗氧化应激酶受到消耗。而应用SFN处理后，SOD和GSH-Px均明显升高，表明氧化应激反应受到抑制。本部分实验结果提示，SFN可以抑制脓毒症心肌组织氧化应激而改善心肌损伤和心脏功能。

细胞凋亡参与脓毒症的发病过程，它可以通过外部或内在刺激被触发。ROS的过量产生能够使脂类发生过氧化反应，破坏细胞膜的完整性，形成凋亡小体，通过DNA裂解和染色质凝集与caspase反应，启动凋亡通路，加重脓毒血症心肌损伤[11,14]。有学者研究发现，内质皮素通过抑制内质网应激导致的凋亡而保护脓毒症导致的心肌损伤[15]。本实验中，CLP组小鼠盲肠结扎穿孔造模之后，凋亡指数增加，促凋亡蛋白Bax及Caspase-3表达水平也明显增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平表现为明显下降(P<0.05)，表明脓毒症小鼠心肌组织发生凋亡。而应用SFN处理后，上述凋亡指标发生了反转(P<0.05)，表明SFN可以减弱脓毒血症导致的心肌凋亡。这些结果提示，SFN对脓毒症心肌损伤的保护作用，也可归因于其抗凋亡作用。

综上所述，我们的研究数据首次证实萝卜硫素可有效保护脓毒症导致的心肌损伤，其机制可能与抑制线粒体氧化应激反应及抗凋亡有关。因此，萝卜硫素应该被视为预防脓毒症心肌损伤潜在治疗药物。

(致谢：本课题在郑州大学第一附属医院重点实验室完成，特别感谢实验的指导老师及各位参与者！)