甘草酸对 LPS 诱导的小鼠急性肺损伤中ACE2的影响

瞿利花，陈阳晔，李 懿，何 炜，张 冉，申 丽

（1.湖南师范大学医学院，长沙 410013；2. 中南大学湘雅三医院，长沙 410013）

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）由内、外因素，严重的感染、休克、创伤和误吸等诱因引起，临床表现为呼吸困难和低氧血症［1］。ALI特征为肺泡-毛细血管破坏，大量炎性细胞浸润，促炎因子和细胞毒性介质释放。ALI最终发展成呼吸衰竭和全身多器官功能衰竭而致死亡［2］。ALI 的死亡率为 40%-50%［3］。ALI 的早期治疗对预防疾病的恶化非常重要。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）又名内毒素，它能诱导机体感染，已被广泛应用于研究 ALI 的模型中［4］。目前临床上常用的治疗 ALI 的药物大多为抗生素和糖皮质激素类，易产生耐药性和副作用大等问题，因此有效的药物，对于预防和治疗 ALI十分必要。

甘草酸（Glycyrrhizic acid，GA）是甘草中的主要活性成分之一，是一种五环三萜系列皂苷，五环三萜结构具有抗感染和抗病毒等作用且不良反应少［5-6］。临床上通常把甘草制剂用来治疗病毒性肝炎等［7］，而它在预防和治疗 ALI 方面的应用很少。因此，研究 GA 在 ALI中的保护机制，可以为甘草这种物美价廉的中草药，在急性肺损伤疾病的推广应用中奠定基础。

血管紧张素转换酶-2（Angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是血管紧张素转换酶（ACE）的同工酶，在2000 年被单独克隆出来［8］。ACE2 可以切割 Ang I以产生无活性的 Ang-（1-9）肽，然后 ACE 或中性内肽酶（NEP）将其转化为血管舒张肽 Ang-（1-7），它能拮抗血管紧张素 II（Ang-II）引起的细胞损伤［9］。Ang-II 在ALI 过程中能引起炎症反应，它能被ACE2 降解。ACE2的缺失，导致由 Ang II 诱导的炎性细胞在主动脉的表达显著增加，加重血管炎症［10］。然而，GA 是否可以通过调节ACE2 来影响 ALI 的进展尚无报道。本研究旨在探讨 GA 对 LPS 诱导的 ALI 模型的保护并初步阐明GA 发挥作用的具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂甘草酸购自上海TCI 化成发展有限公司；LPS购自美国 Sigma 公司；ACE2多克隆抗体购自武汉三鹰生物公司；IHRP 标记山羊抗兔 IgG购自武汉塞维尔生物公司。

1.2 实验动物分组60 只小鼠随机分 4 组：（1）对照组（Ctrl 组）；（2）GA 组 ：GA（200 mg/kg）；（3）LPS 组 ：LPS（10 mg/kg）；（4）GA+LPS 组 ：GA（200 mg/kg）1 h 后 LPS 给药（10 mg/kg），所有的药物都是腹腔注射。8 h 后取肺组织并称量肺湿重（g），样本置于-80℃冰箱保存备用。

1.3 肺系数肺系数=（肺湿重体重比，Lung Coefficient）：是一项动物实验的测量指标，通常用来评估肺水肿程度，肺湿重（g）/体重（kg）×100%。取出小鼠全肺后，剔除多余组织、去除血迹，称重（g），计算肺系数。

1.4 HE染色和免疫组化肺组织切片HE 染色，按照常规烤片-脱蜡-至水-染色-脱水-透明-封片进行。 肺组织免疫组化经石蜡切片脱蜡后用EDTA进行抗原修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。用BSA封闭2 h后，滴加稀释好的一抗，4℃过夜。滴加二抗，室温孵育1 h，滴加DAB显色液，苏木素复染细胞核1 min，脱水封片，显微镜观察。

1.5 Western blotting检测蛋白表达肺组织蛋白SDS-PAGE凝胶电泳；蛋白条带转移到甲醇浸泡活化后的PVDF膜上，5%的脱脂牛奶室温封闭 1 h；加入一抗4℃冰箱孵育15～18 h；PBS洗涤后常温孵育二抗 1 h；用ECL化学发光显色液，显影成像。用Image J测定各条带灰度值。

1.6 统计学分析使用 SPSS 16.0 软件分析实验数据，用 One-way ANOVA 单因素方差分析检验，结果以均数±标准差表示。双侧P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GA对肺组织形态学的影响LPS处理后小鼠肺系数明显升高（P<0.05）；GA给药后组肺系数明显低于LPS组（P<0.05，图1A）。HE染色结果显示：Ctrl 组肺泡组织结构完整，肺间质未见炎性细胞。LPS组肺泡结构破坏明显，肺间质可见大量炎性细胞浸润。而GA+LPS 组肺间质炎性细胞浸润明显减少（图1B）。

图1 GA 对肺组织形态学的影响 A：肺系数，与Ctrl组相比***P<0.001；与LPS相比##P<0.01；B：小鼠肺组织病理变化（HE×200）。

2.2 GA 对肺组织 ACE2 的影响Western blotting和免疫组织化学结果显示，与Ctrl组相比，LPS 能下调ACE2的表达（P<0.05）；与LPS组相比，GA 处理后能显著上调 ACE2 的表达（P<0.05，图2）。

图 2 GA 对肺组织 ACE2 的影响 A ：与Ctrl组相比，*P<0.05 ；与LPS相比，#P<0.05 ；B ：肺组织免疫组化ACE2 蛋白的表达（×200）。

3 讨论

在 ALI的发展过程中肺泡－毛细血管破坏，炎性细胞不断聚集，导致了持续进展性的肺部炎症［11-13］。当这些症状无法得到有效缓解与控制时，往往发展为呼吸衰竭最终导致患者死亡。 目前的药物治疗仍旧无法满足患者的需要，这也是 ALI 死亡率较高的主要原因。因此，寻找影响 ALI 发生发展中的特异性靶分子意义重大。

GA能发挥多种生物学功能。研究表明，GA能够抑制角叉莱胶诱导的胸膜炎与支气管肺泡灌洗液中炎性细胞的浸润［14］；也有研究发现 GA 具有显著的抗SARS 病毒作用［15］。这些研究提示，GA可能作为一种有效的药物，用于肺部疾病的治疗。我们的实验研究结果表明，GA 治疗后明显缓解小鼠肺组织水肿和炎性细胞浸润。由此我们发现GA 对肺组织具有保护作用，能够缓解 LPS导致的ALI。

ACE2在ALI中起着重要的作用。研究发现，丹参酮 IIA 能够上调 ACE2 的表达，进而缓解百草枯诱导的ALI［16］。此外，脂氧素 A4 也可通过活化 ACE2-Ang（1-7）-Mas 信号改善 LPS 诱导的 ALI［17］。我们的研究发现，GA 能够缓解 LPS 引起的 ACE2 表达减少，由此提示，GA 对 ALI 的保护作用可能是通过上调 ACE2 来实现的。

本研究通过LPS诱导的ALI的小鼠模型，小鼠肺组织出现明显肺损伤，肺组织ACE2表达下调；GA处理后减轻肺损伤，肺组织ACE2水平上调，说明GA能明显减轻LPS诱导的ALI的损伤程度，其机制可能与ACE2 激活有关。然而ALI发病机制复杂，GA治疗ALI的具体作用机制仍需进一步探究。