基于分子对接技术筛选金银花降尿酸物质基础

彭磊

(河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450046)

《2017年中国痛风现状报告白皮书》指出:我国高尿酸血症患者人数已达1.7亿，且高尿酸血症患者每年正以9.7%的年增长率发展为痛风，是不可忽视的健康警示，但是目前还未引起大家足够的重视。此外，大量的流行病学研究数据显示，高尿酸血症不仅是冠心病[1]、慢性肾病[2]的独立危险因子，而且还与糖尿病、肥胖[3-4]等有着密切的联系。无疑，高尿酸血症正严重威胁着人类健康。金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb. )的干燥花蕾或带初开的花，其味甘，性寒，归肺、胃、心经，具有清热解毒、疏散风热的作用，临床中常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒等症[5]。课题组前期对金银花进行了初步的降尿酸药效研究，同时结合高效液相-质谱联用技术对其有效部位进行了化学成分分析，发现金银花发挥降尿酸药效可能与异绿原酸B、异绿原酸A、芦丁、绿原酸、秦皮甲素、秦皮乙素有关(结构见图1)，但是还未得到进一步的证实。因此，本研究通过分子对接技术将上述成分与XOD进行虚拟筛选，进一步优化出对XOD抑制率较高的活性成分，并结合整体动物试验进行降尿酸药效验证，通过体内外试验相结合模型，初步阐明金银花发挥降尿酸药效的物质基础，为金银花的深入开发和高尿酸血症的防治提供参考和依据。

图1 金银花中筛选的小分子化合物结构

1 材料

1.1 药材

异绿原酸B(纯度>99%，批号：20180721，四川省维克奇生物科技有限公司)；秦皮甲素(纯度>98%，批号：20180616，成都德思特生物技术有限公司)；非布司他片(批号：1903710，江苏万邦生化医药集团有限责任公司)。

1.2 试剂

尿酸(UA)试剂盒(批号：190561，中生北控生物科技股份有限公司)；黄嘌呤氧化酶(XOD)试剂盒(批号：20190629，南京建成生物工程研究所)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，批号：20170131，国药集团化学试剂有限公司)；D-果糖(批号：3623C327，英国AMRESCO公司)。

1.3 仪器与设备

Sunrise酶标仪(瑞士 Tecan 公司)；LXJ-Ⅱ恒温高速离心机(上海医用分析仪器厂)；SHZ88-1型恒温水浴箱(北京医疗设备厂)；SHIMADZU电子天平(日本岛津公司)。

1.4 实验动物

SPF级Wistar大鼠，雄性，清洁级，5周龄，体质量(180±10)g，购自郑州大学医学院动物实验中心，合格证号:SCXK (豫) 2015-0002。

2 方法

2.1 分子对接试验

2.1.1 受体处理

XOD由2个完全对称的亚单元组成，每一个亚单元可单独发挥催化作用，其催化中心包括1个钼喋呤(Mo-pt)中心、1个黄素腺嘌呤二核苷酸( FAD)及2个铁硫中心(Fe/SI，Ⅱ)。参考文献[6]，使用pymol v.1.6.x 软件删除B链，保留FAD、Mo-pt、Fe/SI，抽取出原配体非布司他，并删除水分子，将处理好的受体和配体分别保存为PDB 格式备用。

2.1.2 配体处理

使用ChemBio3D绘制异绿原酸B、异绿原酸A、芦丁、秦皮甲素、绿原酸、秦皮乙素的三维结构，并将其保存为PDB格式备用。

2.1.3 分子对接

将“2.1.1”中处理好的受体与“2.1.2”中处理好的配体在Vina分子对接软件下进行分子对接研究。

2.2 整体动物试验

2.2.1 给药剂量及溶液配备

异绿原酸B、秦皮甲素的给药剂量均为50 mg/kg，阳性药非布司他给药剂量为4.8 mg/kg，上述药物均采用0.4% CMC-Na溶解，灌胃体积为1.2 mL/100 g。

2.2.2 造模方法

参考文献[7]采用果糖与水1∶10比例配制。

2.2.3 动物分组及给药

SPF级Wistar大鼠50只，雄性，体质量(180±10)g，适应性饲养7 d后，按体质量随机分为5组，每组10只。分别为正常组、模型组、非布司他组、秦皮甲素组和异绿原酸B组。正常组给予清水，其余各组均给予10%果糖水复制高尿酸血症大鼠。非布司他组、秦皮甲素组和异绿原酸B组给药剂量见“2.2.1”；正常及模型组给予同等体积的0.4% CMC-Na水溶液。实验室湿度(60±10)%，温度(25±5)℃，实验周期为21 d。

2.2.4 血清收集与处理

动物取血前12小时禁食不禁水，并称量体质量，于实验第7、14、21天剪大鼠尾尖取血，待血液室温放置至析出血清后在3 000 r/min离心10 min，分离血清，检测大鼠血清UA、XOD水平。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 分子对接结果

3.1.1 准确性验证

使用chimera软件将XOD中的原配体非布司他构象提取出来，然后利用AutoDock将配体分子对接回已处理好的受体蛋白结合位点，对接后的配体分子与原配体分子的均方根偏差RMSD=0.781 Å<2 Å，较好地重复出了原受-配体结合的构象。同时，分子对接预测的非布司他对靶蛋白的结合常数Ki为280.94 nmol/L,与文献[8]报道的生物活性处于同一数量级，表明分子对接过程所设置的参数较合理。

3.1.2 分子对接结果

非布司他与XOD的结合能为-8.94 kcal/moL，异绿原酸B、异绿原酸A、金银花酸、绿原酸、秦皮甲素、秦皮乙素与XOD结合能分别为-12.16、-9.22、-6.41、-10.92、-10.15、-8.12 kcal/moL，其中异绿原酸B、异绿原酸A、绿原酸、秦皮甲素结合能高于非布司他，表明上述化合物与XOD有较好结合，对XOD具有较强的抑制率，可能为金银花发挥降尿酸的物质基础(与XOD分子对接结果及二维平面图结果分别见表1和图2)。

表1 金银花小分子化合物及阳性药与XOD分子对接结果

图2 金银花小分子化合物及非布司他与XOD相互作用平面图

3.2 体内验证结果

从分子对接部分得到异绿原酸B、异绿原酸A、绿原酸、秦皮甲素对XOD显示很高的抑制活性，因此，本实验初步选异绿原酸B、秦皮甲素进行体内降尿酸药效验证，以验证分子对接结果的合理性。

3.2.1 各组大鼠体质量情况比较

实验期间，各组大鼠体质量未见显著差异(P>0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠体质量情况比较

3.2.2 各组大鼠血清UA水平比较

实验期间，与正常组相比，模型组大鼠血清UA值在7～21 d均显著增高(P<0.05)，说明大鼠高尿酸血症造模持续成功；与模型组相比，在给药第7～21天内，非布司他组、秦皮甲素组、异绿原酸B组大鼠血清UA均显著小于模型组(P<0.05)，说明三者均具有较好的降UA药效，结果见表3。

表3 各组大鼠血清UA变化

3.2.3 各组大鼠血清XOD水平比较

实验期间，与正常组相比，模型组大鼠血清XOD活性在14～21 d显著升高(P<0.05)；与模型组相比，除秦皮甲素组第7天大鼠血清XOD活性无显著差异外(P>0.05)，其余各给药组大鼠血清XOD活性均显著降低(P<0.05)，说明秦皮甲素、异绿原酸B发挥降尿酸药效可能与抑制XOD活性有关，结果见表4。

表4 各组大鼠血清XOD水平比较

4 讨论

目前，控制尿酸水平西药主要分为以下三大类：1)抑制尿酸合成关键酶活性，即通过抑制肝脏XOD的活性来减少尿酸的生成，从而达到降尿酸药效，如别嘌醇、非布司他；2)促进肾脏对尿酸的排泄，即通过调控肾脏尿酸转运蛋白URAT1活性进而达到降尿酸药效，如临床中常用的苯溴马隆[9]；3)促进尿酸分解成尿囊素的药物，如拉布立酶、培格洛酶，但还未在我国境内上市。虽然上述药物作用靶点清晰且降尿酸药效明确，但伴随着上述药物的广泛使用，大量流行病学研究显示，长期服用以上药物存在较严重的不良反应，如临床中常出现超敏、肝损伤、心脏毒[10-12]等报道。鉴于许多现有药物适应证限制及不良反应，导致药物选择受限，因此对高尿酸血症的药物治疗提出更高的要求，研究安全、有效的降尿酸药物势在必行。

近年来，分子对接技术由于其具有节省研究成本且缩小药物开发周期等优势，已成为大规模药物分子虚拟筛选的主要途径和方法[13]。本次研究分子对接结果显示，金银花中异绿原酸B、异绿原酸A、绿原酸、秦皮甲素4种化合物对XOD的结合能大于非布司他，说明上述成分与阳性药非布司他相比均显示显著的XOD抑制活性。同时，笔者还使用Pymol软件及ligplot软件分析观察金银花小分子化合物与XOD对接结果，以异绿原酸B为例，3取代咖啡酰基3-OH与Glu802 OE1形成1个氢键，4取代咖啡酰基C3-OH与Ser876 OC和Glu879 OE1各形成1个氢键，奎宁酸与Lys771 NC形成1个氢键，并与Leu648、Pro1076、Phe1013、Phe649、His875、Leu1014、Thr1010、Phe1009、Leu873、Ala1078、Ala1079、Phe914、Phe649之间存在疏水作用，有报道[14]显示残基Glu802在XOD羟基化过程中发挥重要作用，与本次研究结果一致。

此外，整体动物实验结果表明，秦皮甲素与异绿原酸B均具有显著的降尿酸药效和抑制XOD活性。向小四[15]采用黄嘌呤+氧嗪酸钾复制小鼠高尿酸血症，连续7 d给予高剂量(200 mg/kg)、中剂量(100 mg/kg)、低剂量(50 mg/kg)剂量秦皮甲素，结果显示三个剂量均可显著高尿酸血症模型小鼠的血清尿酸值，与笔者研究结果一致，进一步证实了分子对接筛选结果的合理性。本实验不足之处是未对绿原酸和异绿原酸A进行降尿酸药效验证，后期课题组将对上述成分进行药效验证及机制研究，以丰富金银花发挥降尿酸药效的物质基础。综上，本研究初步明确了金银花发挥降尿酸的物质基础，同时也为金银花的质量控制指标的选择和降尿酸药物的开发提供依据和参考。