BK多瘤病毒microRNA研究进展

周显凤，倪贤生

(传染病预防控制国家重点实验室研究基地，江西省动物源与媒介生物性传染病重点实验室，南昌市疾病预防控制中心微生物检验科，南昌 330038)

BK多瘤病毒(BK polyomavirus,BKV)是多瘤病毒家族成员之一，人群感染率高达90%，因能导致肾移植受者病毒性肾病而备受关注[1]。BKV原发感染时会出现“流感样”症状，感染后通常潜伏于人泌尿系统上皮细胞中，肾脏移植后免疫抑制剂使用是导致BKV活化的重要因素，血液中持续的高病毒载量会引起肾移植组织损伤从而导致病毒性肾病(BKV-associated nephropathy,BKVAN)[2]。肾移植受者中约有近10%的患者发展为BKVAN，深入了解BKV的生物学特征及其与宿主的关系对预防疾病的发生和控制疾病进程至关重要。近几年，有关BKV microRNA(miRNA)在病毒感染与宿主免疫的研究不断增多，提示BKV miRNA在疾病诊治、预防和控制中起关键作用。

1 BKV生物学特征及流行病学

BKV是1971年从肾小管狭窄的肾移植患者中分离到的第一个人多瘤病毒，病毒命名来源于患者名字的首字母“BK”[3]。BKV是乳头状多瘤空泡病毒科、多瘤病毒家族的一种亚型[4]。BKV是双链环状DNA病毒，其基因组大约5 kb，按功能分为3个区域：早期表达区域(大T、小T抗原)、非编码控制区(non-coding control region,NCCR)以及晚期表达区域(病毒衣壳蛋白VP1-VP3编码区)，晚期表达区域含有一个miRNA转录子，其与早期转录T抗原mRNA的3′端互补(封四图1A)，被认为参与调控病毒早期基因表达和复制；成熟的3p和5p miRNA来源关于发卡结构的前体miRNA(pre-miRNA)(封四图1B)[5-7]。

自BKV发现以来，至今一共有13种人多瘤病毒被发现并命名[4]。BKV原发感染多在10岁以前，传播机制仍不清楚，可能经有呼吸道或者口腔传播[8]。据血清流行病学调查显示儿童在5岁以前的BKV血清阳性率高达50%，成人中的感染率高达90%以上[9]。对于免疫功能健全的人群，绝大部分终身都不会出现明显的BKV感染症状或体征，但病毒可以一直潜伏在泌尿系统上皮细胞中。当机体免疫力低下，如HIV感染或器官移植后，潜伏在尿路上皮和肾小管上皮中的BKV被激活，开始高水平的病毒复制，大量复制的病毒颗粒从尿路中排泄，造成BKV尿症(viruria)[10-12]。在肾移植受者中，随着病程的进展，BKV会进入肾小管上皮细胞细胞核进行大量复制产生子代病毒，引起细胞坏死使组织发生免疫性、炎症性侵润；当肾小管上皮细胞脱落和基底膜暴露时，病毒开始破坏肾小管毛细血管进入血液，导致病毒血症(viremia)，约有20%的肾移植受者会出现viremia。当BKV在血液中持续高病毒载量表达，将进一步破坏移植肾组织导致肾小管萎缩和间质纤维化，最终形成病毒性肾病(BKVAN)——BKV造成的最典型的疾病特征[13-15]。此外，出血性膀胱炎(HC)是造血干细胞移植(HSCT)受体中公认的BKV相关并发症。越来越多的研究[16-17]证据表明，BKV编码的miRNA参与调控病毒早期转录、病毒复制以及病毒免疫逃逸从而导致病毒活化和疾病恶化。

2 BKV编码的miRNA

miRNA是一类单链、非编码的RNA分子，长度一般为20～23个核苷酸。miRNA不编码蛋白，而是通过与mRNA的3’端非编码区的结合位点结合，降解或抑制mRNA的翻译来抑制基因的表达，从而参与细胞发育、分化、凋亡等多种生物学过程。目前，编码miRNA的病毒主要是疱疹病毒科的病毒如EB病毒、卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、人巨细胞病毒(MCV)和1型单纯疱疹病毒(HSV-1)以及多瘤病毒科[18-21]。2005年SULLVIAN等[22]通过基因组扫描和前体miRNA预测得出与多瘤病毒SV40早期转录有关的段片段RNA为病毒编码的miRNA，随后miRNA相继在包括BKV的其他多瘤病毒中报道[23]。目前已经确定的多瘤病毒编码的miRNA及相关功能[5-7,24-25]总结如下，见表1。

表1 多瘤病毒miRNA及主要功能

2.1 BKV miRNA参与调控病毒复制

虽然多瘤病毒miRNA主要参与下调早期转录子翻译等功能，但这些miRNA功能的具体机制尚不清楚。迄今为止，科研人员在不断探索这些未知的机制机理。SULLIVAN 等[22]研究发现SV40编码miRNA既能调节病毒早期基因表达，也参与宿主免疫逃逸。SEO等[23]通过实验研究显示BKV和JCV编码miRNA抑制病毒早期基因表达从而影响病毒的复制水平。BROEKEMA等[26-27]还发现BKV编码的miRNA与病毒潜伏机制有关，他们认为高水平表达的miRNA通过与早期T抗原mRNA 3’端互补控制病毒的复制。TIAN等[28]通过体外实验发现BKV microRNA通过抑制T抗原介导的自调控降低病毒的复制水平。

BKV基因组根据NCCR区的基因结构可分为原型(Archetype)和重排型(Rearranged)，原型因在健康人群和病毒致病人群中均被发现而被认为是病毒的传播型，重排型往往在病毒治病的人群中检测到而被定性为致病型或者活化型。原型BKV NCCR结构可以分为O,P,Q,R,S共5个序列模块(图1A)，重排型则是这些序列模块的部分重复或者缺失[29-30]。BROEKEMA等[5]通过体外实验证明miRNA主要负责控制原型BKV的病毒复制，使其长期保持潜伏感染状态(封四图2)。BROEKEMA等[5]还推断miRNA表达受NCCR区相关启动子的影响，并认为除NCCR区启动子以外可能在晚期DNA链中还隐藏着能启动miRNA表达的启动子。目前，未见其他有关病毒潜伏机制的报道，关于miRNA与病毒潜伏机制的关系仍然需要更多的实验和临床证据。

2.2 BKV miRNA参与病毒免疫逃逸

病毒miRNA除参与病毒复制调控意外，还与病毒逃逸宿主免疫有关。以往关于疱疹病毒的研究[31-32]表明，由3种不同的疱疹病毒(EBV、KSHV和HCMV)编码的3种不同的病毒miRNA可以选择性地靶向应激诱导配体MICB，而不是其他应激诱导配体，如ULBPs或MICA。MICB被NK细胞和其他免疫细胞表达的强大杀伤受体NKG2D所识别。因此，病毒miRNA对MICB的下调导致感染细胞从NKG2D介导的免疫识别和消除中逃逸[33-35]。由于人类多瘤病毒和疱疹病毒与人类宿主共存，它们均可以在免疫抑制条件下引起严重疾病。再者，因为BKV和JCV编码miRNAs，所以研究人员推测BKV和JCV miRNA也可以靶向NKG2D配体，以逃避NKG2D介导的病毒清除。BAUMAN等[7]发现BKV 3p miRNA特异性下调应激反应诱导配体ULBP3的表达导致降低NKG2D受体依赖的NK细胞介导的细胞杀伤性；反之，病毒miRNA收到抑制会恢复配体ULBP3的表达，从而促进NK细胞毒作用。因此，开发miRNA靶向药物用于精准治疗病毒性肾病及相关多瘤病毒疾病具有广阔的应用前景和临床价值。

2.3 临床样本BKV miRNA检测对疾病进展的诊断价值

当前没有针对BKVAN的特效治疗药物，减少移植后免疫抑制剂的使用是控制病毒活化和疾病进程的主要手段[12]。既然miRNA参与调控病毒宿主免疫，且于病毒活化相关联，那么定量检测临床样本BKV miRNA含量是否有助于了解病毒活化状态及疾病进程是值得探讨的议题。HUANG等[36]对肾移植患者移植手术后不同时期的血液和尿液开展了BKV miRNA的定量检测，同时还分析了血、尿BKV miRNA与病毒基因组和VP1 mRNA的定量关系。其结果提示BKV优选3p miRNA参与宿主细胞mRNA调控，并认为BKV miRNA介导NKG2D配体ULBP3下调的免疫逃逸影响远大于其抑制病毒复制的作用，提示miRNA表达水平可与病程进展相关。因此，血、尿以及其他临床标本病毒miRNA的定量检测对辅助疾病诊断具有重要的价值[16,37]。无论如何，miRNA的检测需要灵敏度高、特异性强的检测方法，同时临床样本的保存条件也是影响miRNA检测精度和真实度的重要因素。因此，对于肾移植受者来讲，除了目前最新的临床诊疗规范(2019版)推荐的尿液“诱饵细胞”(decoy cells)显微镜检、血尿病毒载量监测以及活组织检查外，同时开展病毒miRNA监测用于辅助诊断具有实质的临床价值，同时利用接受者操作特性(ROC)曲线评估各指标的诊断灵敏度，为提出更合理且可操作的临床和实验诊断标准提供基础。

3 小结

近年来，随着实体器官移植手术的广泛开展，新型强效免疫抑制剂的广泛应用以及检测手段的革新，BKV 致病率不断升高。肾移植术后BKV 致病率升高尤为突出，由其导致的BKVAN已成为移植肾失功的重要原因之一。

BKVAN 的临床表现缺乏特异性，容易与移植物排斥反应或其他疾病相混淆，尤其是急性排斥反应，后者治疗需要增加免疫抑制强度以降低机体免疫导致的排斥反应，而BKVAN的预防治疗恰恰相反，必须降低免疫抑制强度，以期部分恢复机体抗病毒免疫能力。所以，正确诊断并及时干预有助于改善移植受者的预后。血、尿BKV病毒载量监测是作为BKVAN风险评估的主要指标，当血BKV DNA载量>1.0×104copies·mL-1时，病变发展为BKVAN的风险极高，阳性预测值高达80%以上[12]。因为BKV miRNA表达发生在病毒复制前，且反映了病毒基因表达情况，可以作为病毒活跃复制的指征。其次，BKV miRNA序列非常保守，开发miRNA诊断方法可以有效覆盖所有基因型BKV。

尽管BKV miRNA参与病毒转录复制及宿主免疫逃逸的相关研究关注度不断提升，但目前的研究结论仍无法明确其调控机制。miRNA靶向序列众多，BKV miRNA除靶向病毒本身早期T抗原mRNA和ULBP3外，是否还参与调控其他的细胞mRNAs是值得深入探索的方向。总之，深入研究BKV microRNA参与宿主和病毒之间的相互作用将对病毒性肾病早期诊断、治疗和预防提供新的思路。