丹参酮ⅡA预防大鼠椎板切除术后硬膜外疤痕增生的机制分析

史宗坡 王刚 王彬彬 贾根 刘军

丹参酮ⅡA是丹参的有效成分,其作为一种心血管药物,广泛应用于临床[1]。此外有研究证明,丹参酮ⅡA可诱导疤痕组织中成纤维细胞凋亡,从而达到抑制其增生的作用,但具体机制尚未阐明[2]。本次研究旨在比较不同浓度丹参酮ⅡA干预对SD大鼠椎板切除术后硬膜外疤痕增生的效果,以期为今后丹参酮ⅡA应用于临床奠定理论依据,现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 实验动物及分组 选取北京大学医学院实验动物中心提供的雄性成年Sprague-Dawley大鼠24只,清洁级,体质量250～300 g,自然光照下常规饲养,室温保持在23 ℃左右。根据随机数字表将其分为Ⅰ～Ⅳ组，每组各6只。实验大鼠均健康,Ⅰ组平均体质量为(232.7±7.6)g,Ⅱ组平均体质量为(233.5±7.7)g,Ⅲ组平均体质量为(233.0±7.5)g,Ⅳ组平均体质量为(231.9±7.4)g,组间差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 实验仪器及试剂 (1)Attune NxT流式细胞仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司);(2)Eppendorf 5427 R台式高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司);(3)奥林巴斯CX23显微镜(日本奥林巴斯株式会社);(4)电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司);(5)10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司);(6)二甲基亚砜(南京东德化工有限公司);(7)免疫组织化学SP试剂盒(美国Sigma公司);(8)p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白检测试剂盒(北京泰泽瑞达科技有限公司);(9)小动物高场磁共振成像仪,型号:Biospec 7T/20 USR(德国Bruker公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 L1椎板切除SD大鼠模型制备:大鼠均以10% 水合氯醛(2.5～3.0 mL/kg)腹腔注射麻醉,俯卧位固定。背部脱毛备皮,取鼠脊柱正中切口长约2 cm,显露L1和L2椎板,切除全L1椎板,显露硬脊膜,压迫止血。

1.3.2 丹参酮ⅡA干预动物模型的建立:将丹参酮ⅡA溶解于二甲基亚砜,Ⅰ组按100 mg/kg剂量制成10 mL溶液给予腹腔注射;Ⅱ组按200 mg/kg剂量制成10 mL溶液给予腹腔注射;Ⅲ组按300 mg/kg剂量制成10 mL溶液给予腹腔注射。Ⅳ组腹腔注射10 mL生理盐水。

1.3.3 瘢痕面积测量:干预后1个月，每组随机选取3个标本进行MRI扫描(磁场强度:7T,高分辨像,横切面图像,序列:15层,层厚0.8 mm,层间距1.3 mm),应用REGION OF INTEREST TOOL对所选MRI图像硬脊膜后方感兴趣区进行测定并计算瘢痕面积。

1.3.4 成纤维细胞凋亡率和细胞周期G0/G1期比例计算:于干预后24 h、72 h和120 h时精确切取各组大鼠约0.5 g疤痕组织,分别制备细胞悬液,根据Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测专用试剂盒的说明书进行操作,利用流式细胞仪检测疤痕组织中成纤维细胞凋亡率。将上述时间点制备的细胞悬液接种于培养皿,经乙醇固定、PBS洗涤、孵育、染色后用300目筛网过滤,调整细胞浓度至109/mL,由流式细胞仪检测,计算细胞周期G0/G1比例。

1.3.5 检测p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平:干预后120 h取大鼠疤痕组织,制备成纤维细胞悬液,于4 ℃下裂解20 min,提取总蛋白,测定蛋白浓度并定量。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏氟乙烯膜,室温下用脱脂奶粉封闭2 h,加入1∶500稀释的一抗后室温孵育过夜,三乙醇胺缓冲盐溶液(TBS)洗涤2次,加入1∶500稀释的二抗,室温孵育2 h,TBS洗涤2次。通过增强化学发光法显影检测,以p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3与内参β-actin蛋白的积分光密度(IOD)比值作为上述蛋白的相对表达量[3]。

2 结果

2.1 各组大鼠瘢痕面积比较 术后所有大鼠伤口愈合良好。干预后1个月，4组瘢痕面积差异有统计学意义(P<0.05),由大到小依次为Ⅳ组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组[(2.56±0.12)mm2,(1.92±0.10)mm2,(1.77±0.12)mm2,(1.51±0.09)mm2]。

2.2 各组大鼠成纤维细胞凋亡率和细胞周期G0/G1期比例比较 4组干预后24 h、72 h及120 h,不同时间点的成纤维细胞凋亡率差异有统计学意义(F=22.663,P<0.001);4组间成纤维细胞凋亡率差异有统计学意义(F=25.223,P<0.001),其中Ⅲ组成纤维细胞凋亡率较高;4组的成纤维细胞凋亡率变化趋势差异有统计学意义(F=18.004,P<0.001)。4组不同时间点的G0/G1期比例差异有统计学意义(F=14.884,P<0.001),4组间比较,差异也有统计学意义(F=23.661,P<0.001),其中Ⅲ组G0/G1期比例较高;4组的G0/G1期比例变化趋势差异有统计学意义(F=18.337,P<0.001)。见表2。

表2 各组大鼠成纤维细胞凋亡率和细胞周期G0/G1期比例比较

2.3 各组大鼠瘢痕组织p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平比较 干预后120 h 4组瘢痕组织中p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平差异均有统计学意义(P<0.05),p53、Caspase-3和Bax表达水平由高到低依次为Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组和Ⅳ组,survivin和Bcl-2表达水平由高到低依次为Ⅳ组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组。见表3。

表3 各组大鼠瘢痕组织p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达水平比较

3 讨论

椎板切除术是脊柱外科中最常用的椎管减压手术术式之一,但术后椎板切除区域常出现成纤维细胞大量增殖和细胞外基质代谢异常,导致硬膜外瘢痕粘连,并牵拉邻近区域硬膜和神经根,引起一系列相应症状,严重影响手术疗效,这也正是下腰椎术后失败综合征发生的主要原因[4]。尽管硬膜外瘢痕粘连可以通过二期手术得以松解,但粘连常在术后2～4周后再次发生,甚至会产生更多瘢痕,需要再次手术，使医源性神经根损伤和硬膜撕裂的危险大大增加[5]。因此,预防或减少椎板切除术后硬膜外瘢痕形成,一直是骨科领域备受重视的课题,其对提高椎板切除术疗效具有重要意义[6]。中医药在治疗增生性瘢痕方面历史悠久,随着中药有效成分提炼技术的不断改进,其疗效不断增加[7-8]。丹参酮ⅡA是由丹参根部提取的有效脂溶性成分之一。研究发现参酮ⅡA具有诱导疤痕组织中成纤维细胞凋亡、抑制其增生的作用,而椎板切除术后硬膜外瘢痕主要是由于硬膜后方的成纤维细胞增殖而形成的[9-10]。若丹参酮ⅡA可以有效地诱导SD大鼠椎板切除术后瘢痕组织中成纤维细胞的凋亡,将为抑制硬膜外瘢痕组织增生提供一种新的给药选择[11-12]。

从本次研究的结果来看,术后所有大鼠伤口愈合良好,干预后1个月，4组瘢痕面积差异有统计学意义(P<0.05),由大到小依次为Ⅳ组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组,一方面证实丹参酮ⅡA具有抑制疤痕增生的作用,另一方面这种抑制作用随丹参酮ⅡA浓度的增加而提高。4组干预后24 h、72 h及120 h的成纤维细胞凋亡率和G0/G1期比例比较,差异均有统计学差异(P<0.05),其中Ⅲ组成纤维细胞凋亡率和G0/G1期比例较高,4组成纤维细胞凋亡率和G0/G1期比例差异均有统计学意义(P<0.05),与陈刚等[13]研究结果一致,提示丹参酮ⅡA抑制疤痕增生是通过诱导成纤维细胞凋亡和阻滞细胞周期完成的。p53为经典抑癌基因,Caspase-3是Caspase家族的促凋亡蛋白,Bcl-2和Bax分别为Bcl-2家族的抑凋亡和促凋亡蛋白,而survivin是凋亡抑制蛋白家族中的成员,上述5种细胞因子均在细胞增生和凋亡的平衡中发挥重要作用[14]。本研究显示,干预后120 h,4组瘢痕组织中p53、survivin、Bcl-2、Bax和Caspase-3表达差异均有统计学意义(P<0.05),说明丹参酮ⅡA发挥抑制成纤维细胞增殖,诱导凋亡的作用可能与上调p53、Caspase-3和Bax蛋白表达,下调survivin和Bcl-2蛋白表达有关。本次研究的主要不足在于动物实验的局限性,动物与人体组织结构尚存在一定差距,丹参酮ⅡA应用于人体是否仍然有效有待进一步探究。同时,丹参酮ⅡA的最佳给药剂量、对其他组织细胞有无毒性作用仍是需解决的关键科学问题。

综上所述,丹参酮ⅡA具有抑制成纤维细胞增殖、诱导凋亡的作用,其效果存在浓度依赖性,机制可能与多种细胞因子的调节有关。