姬松茸发酵液多糖的分离纯化及其抗疲劳作用研究*

黎 轶

（宜春学院体育学院，江西 宜春 336000）

姬松茸（Agaricus blazei Murrill），属于蘑菇科（Agaricaceae） 担子菌，具有一定的药用和食用价值，富含糖类和蛋白质[1]。研究发现，姬松茸发酵液中多糖（AbEXP1-a）具有较强的抗肿瘤、调节免疫力的作用，但是在这方面的研究还处于启蒙阶段[1]。通过对姬松茸发酵液多糖的分离纯化方法进行全面整理，分析纯化多糖的理化性质，同时对其抗疲劳的作用进行深入探究，为姬松茸发酵液多糖的结构关系、生物性质等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验使用从华中农业大学真菌研究所采购的姬松茸菌种，编号华农姬松茸1号。

试验使用仪器包括：HITACHI Himac CR21G高速冷冻离心机，宁波新芝生物科技股份有限公司；MB99-3型自动液相色谱分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；UV-1100紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；DYY-5（8B） 型电泳仪，北京六一仪器厂。

1.2 姬松茸发酵液多糖的分离纯化

1.2.1 制备胞外粗多糖

对姬松茸深层发酵液用超滤仪进行过滤（1 000 mL粗多糖液含多糖13.00 mg·mL-1、蛋白质6.23 mg·mL-1）、纯化，去除全部菌丝体，使用冷乙醇进行沉淀，在4℃的环境中静置12 h，使用体积分数为75%的乙醇对沉淀物进行洗涤，再用60℃热水溶解，10 000 r·min-1离心去除杂质，对上清液进行二次离心处理，干燥后得到姬松茸胞外粗多糖，颜色为棕色。

1.2.2 脱蛋白

将三氯甲烷、正丁醇配制成体积比为4∶1的Sevage混合液。将上述糖溶液稀释成浓度2 mg·mL-1，取150 mL与50 mLSevage试剂（5∶1） 混合，充分振荡30 min，在分液漏斗中静置3 h分层。下层白色絮状沉淀为蛋白质层，分液除去，上层为多糖溶液。此过程重复3次。

1.2.3 脱色

加入浓度为20%的过氧化氢，将多糖溶液的pH调至8.0，多糖溶液呈现出淡黄色，在45℃的环境中静置2 h，将蒸馏水加入到脱色液中透析2次，使用体积为3倍的乙醇对其进行沉淀处理。

1.2.4 DEAE-Cellulose柱层析

在装柱以前需要对其进行DEAE-Cellulose(OH-)常规预处理，使用蒸馏水平衡4个柱体积。柱的规格设置为1.3 cm×30 cm，装填的高度需要保持在30 cm左右，上样量需要控制在100 mg左右。先使用蒸馏水对其进行洗脱；再用0.1 mol·L-1、0.3 mol·L-1和 0.5 mol·L-1的 NaHCO3进行洗脱；最后使用0.1 mol·L-1的NaOH洗脱[2]。速度需要保持在0.3 mL·min-1左右，每一管的收集高度需要保持在3 mL左右。跟踪检测的时候，需要使用苯酚-硫酸法，需标注。

1.2.5 Sephadex G-200柱层析

在装柱以前需要对其进行Sephadex G-200常规预处理，使用蒸馏水对其进行24 h的平衡。柱的规格设置为1.6 cm×50 cm，装填的高度保持在50 cm，上样量控制在20 mg。先使用双蒸水对其进行洗脱；接着使用0.1 mol·L-1的NaCl洗脱。速度需要保持在0.15 mL·min-1，每一管的收集高度需要保持在3 mL。跟踪检测的时，需要使用苯酚-硫酸法[3]。

1.2.6 鉴定纯度

使用凝胶过滤法和醋酸纤维薄膜电泳法2种方法对纯度进行鉴定。

1）凝胶过滤法：Sephadex G-200色谱柱，使用蒸馏水进行洗脱，柱的规格为1.6 cm×50 cm，上样量控制在20 mg左右。速度保持在0.15 mL·min-1，每一管的收集高度保持在3 mL。跟踪检测的时候，使用苯酚-硫酸法[4]。

2） 醋酸纤维薄膜电泳法：缓冲液为0.025 mol·L-1硼砂，pH9.3，电压250 V，醋酸纤维薄膜规格为2 cm×8 cm，电泳时间设置为40 min左右，使用西夫试剂和阿利新蓝染色，使用体积分数为90%的乙醇进行漂洗[5]。

1.2.7 测定分子量

在进行测定的时候，需要按照2000年版中国药典二部附录中规定的多糖分子量分步测定法进行操作。选取10 mg多糖AbEXP1-a样品，添加1 mL流动相使其完全溶解，离心处理以后，选取20 μL作为样量，专用Beck-man System Gold GPC软件完成色谱数据处理。

1.2.8 紫外扫描

将多糖AbEXP1-a配制成浓度为1 g·L-1的水溶液，紫外扫描需要在波长200 nm～400 nm区间完成。

1.3 姬松茸胞内多糖抗疲劳作用

1.3.1 试验对象

选取的小鼠由烟台绿叶制药集团提供，种类为昆明系小鼠，雄性，出生2个月左右，体重35 g左右，将其分为多糖组和对照组2组，每组50只。

1.3.2 灌胃动物模型

多糖组：依据《药用实验方法学》中规定的成人剂量来对小鼠的用药剂量进行设置，使用药剂量可以达到成人的5倍左右。小鼠的标准体重设置为30 g，每日摄取0.2 mL·kg-1的姬松茸多糖制剂，早晚各1次进行灌胃，连续灌胃3周。对照组：使用浓度为0.2 mL·kg-1生理盐水连续灌胃3周。

1.3.3 测试指标及测试方法

1） 力竭游泳时间

将重量为小鼠体重5%的铅丝系在鼠尾，迫使其游泳直到沉底10 s为止，具体方法为实验开始前3 d，每天每只小鼠适应性游泳20 min，水温控制在（20±10）℃，水深40 cm，随后进行无负重游泳训练（游泳过程中用玻璃棒驱赶小鼠，避免小鼠漂浮在水面上，游泳结束后用毛巾擦干并用电暖扇帮助小鼠取暖防止感冒），每天晚上20点开始，将各组小鼠放入80 cm×60 cm×50 cm的塑料泳池中强制游泳90 min，前4周除周日休息外，第五周的周六进行力竭游泳训练并记录具体的力竭时间。记录游泳时间。

2） 耐缺氧试验

最后给药1 h以后，将其放置在250 mL广口瓶内，瓶中放置碱石灰10 g，使用石蜡将瓶口封住。将小鼠进入瓶内到死亡的时间进行记录[6]。

3） 测定血红蛋白

使用氰化高铁血红蛋白法对血红蛋白进行测定，具体方法：小鼠连续灌胃10 d，末次给药30 min后，让小鼠自由游泳5 min取出，断头取血。血样于冰箱中静置后，3 500 r·min-1离心10 min，取上清液，测定血清中血红蛋白含量[7]。

4） 血乳酸水平

将重量为小鼠体重5%的铅丝系在鼠尾，迫使其游泳20 min后采鼠尾血，使用血乳酸测试试剂条完成血乳酸水平测试[8]。

5） 测定血尿素

力竭游泳结束后，采眼眶血，使用中生北控生物科技股份有限公司生产的试剂盒对所选取的100 μL血清进行测试，使用7 200型分光广度计完成血尿素的测定[8]。

2 结果与分析

2.1 姬松茸粗多糖脱蛋白、脱色

使用双蒸水溶解棕色粉末状姬松茸粗多糖，在脱蛋白、脱色处理以后进行醇沉，干燥后为淡黄色粉末。

2.2 多糖的DEAE-Cellulose柱层析

使用双蒸水溶解多糖AbEXP-a，使用水，0.1 mol·L-1、0.3 mol·L-1和 0.5 mol·L-1的 NaHCO3以及0.1 mol·L-1的 NaOH 洗脱。

水，0.1 mol·L-1和 0.3 mol·L-1的 NaHCO3分别洗脱出了3种含量较多的多糖AbEXP1、AbEXP2和AbEXP3 成分；而 0.5 mol·L-1的 NaHCO3和 0.1 mol·L-1的NaOH没有洗脱峰值出现。对AbEXP1和AbEXP2进行收集，同时纯化处理多糖AbEXP1。

2.3 多糖的Sephadex G-200柱层析结果

将多糖AbEXP1溶解，上平衡好的Sephadex G-200凝胶柱，依次用双蒸水和0.1 mol·L-1的NaCl溶液洗脱，结果见图1。

由图1可知，层析AbEXPl后，获得AbEXP1-a和AbEXP1-b，使用0.1 mol·L-1的NaCl继续洗脱没有结果。对AbEXP1-a进行醇沉和浓缩处理，最终获得白色晶体，并对这些白色晶体的纯度进行鉴定，同时对其理化性质进行研究。

2.4 鉴定多糖AbEXPl-a纯度

多糖纯度与普通化合物纯度概念不一样，主要是指在一定的分子量中体现出的均一性。使用醋酸纤维薄膜电泳法和Sephadex G-200凝胶过滤色谱法[4]对其进行鉴定，结果见图2。

从图2可知，多糖AbEXP1-a经Sephadex G-200凝胶过滤呈单一对称洗脱峰，经醋酸纤维薄膜电泳呈现单一天蓝色区带，说明AbEXP1-a为均一组分。

2.5 多糖AbEXP1-a的性质

多糖AbEXP1-a为白色晶体，与稀释的酸、碱和盐溶液相溶，与热水快速相溶，与甲醇和乙醇微溶，不会与有机溶剂如乙酸乙醋、氯仿、丙酮和乙醚等相溶。多糖AbEXP1-a在碘-碘化钾反应和菲林试剂反应中体现出阴性，说明其不属于淀粉物质，还原端所占比例较低；在福林-酚反应和葱酮-硫酸反应中体现为阳性，紫外扫描的吸收峰体现在图谱波长280 nm处，说明其含氮元素。综上所述，多糖AbEXP1-a为结合有蛋白质类。

采用高效液相色谱法测定多糖AbEXP1-a的分子量，其保留时间为15.09 min，与标准曲线比较，得出其分子量为50 kD（以右旋糖苷计）。

2.6 小鼠机体抗疲劳试验结果

姬松茸胞内多糖抗疲劳作用的具体情况见表1。

表1 姬松茸发酵液多糖对小鼠机体抗疲劳能力的影响Tab.1 Effect of Polysaccharide from Agaricus blazei fermentation broth on anti fatigue ability of mice

由表1可知，在力竭即刻，多糖组小鼠的血乳酸含量与对照组相比显著性降低（P＜0.05，P＜0.01）；各组小鼠的血尿素氮浓度对比中，多糖组的血尿素氮浓度均显著低于对照组（P＜0.05）；其力竭游泳时间及耐缺氧时间多糖组数据均优于对照组（P＜0.05）；提示经过24 h的恢复和休息，机体的血乳酸水平恢复正常。

3 结论

经过对姬松茸胞内多糖抗疲劳作用的认真研究以后发现，姬松茸胞内多糖可以使小鼠的缺氧时间和负重游泳时间得到不断的延长，由此可见，姬松茸多糖可以提高机体应激因子的使用能力。陈智毅[9]研究表明姬松茸可以给循环系统产生强烈的应激作用，可以有效增加“下丘脑-垂体-肾上腺皮质”系统的反射性功能，通过不断地自我调节，使其能够快速的适应恶劣的环境，表明姬松茸多糖的抗疲劳作用显著。姬松茸胞外多糖AbEXP1-a的分子量正好处于大分子可溶性活性多糖的范围以内，这就表明姬松茸多糖可以有效提升免疫力[10]。经过大量的试验发现，姬松茸发酵菌丝体中的粗多糖含量要比姬松茸实体中的含量高很多，对姬松茸的深层发酵技术进行全面的推广，将使其在保健品研发过程中发挥积极的促进作用[11]。