乳酸乳球菌K6产Nisin Z的条件优化

匡 珍 李学英 陶乐仁 迟 海*

（1 中国水产科学研究院东海水产研究所 上海200090 2 上海理工大学医疗器械与食品学院 上海200093）

乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中，通过核糖体合成的一类对同种或亲缘关系较近的细菌具有抑制作用的多肽或蛋白质[1]。它具有易降解，无残留，抑菌高效等优点，成为近年来食品生物防腐剂研究开发的热点[2-3]。目前已发现的乳酸菌细菌素大部分对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，而对革兰氏阴性菌有抑制效果的菌株报道较少。在工业化生产应用方面，目前只有乳酸链球菌素（Nisin）通过了美国食品药品管理局和世界卫生组织的许可，应用于食品行业[3]。其原因在于对具有广谱抑菌效应的乳酸菌细菌素的抑菌机理，尚不清楚[4-5]。随着微生物的不断进化，耐Nisin 的致病菌在食品中不断被检出[6]，这极大地限制了乳酸菌细菌素作为天然食品防腐剂的应用。筛选具有广谱抑菌性的乳酸菌细菌素，仍是国内外细菌素的主要研究内容之一。

本研究在前期细菌素筛选过程中，从贻贝中分离出一株具有细菌素特征的乳酸菌，该乳酸菌对常见食品致病菌（金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽胞杆菌等） 有明显的抑制作用，通过16S rDNA 测序鉴定为乳酸乳球菌（Lactococcus latics）（数据另刊发表中）。乳酸乳球菌产的细菌素有很多种（如LsbB，Nisin 和Lactococcin A/B/G/M等）[7-8]，而只有Nisin 具有广谱抑菌效果。已发现的Nisin 有6 种天然异构体，Nisin A 和Nisin Z 是研究最为广泛的两种[9-10]。两者抑菌效果相同，主要区别在于氨基酸序列中第27 位氨基酸不同，其中Nisin A 第27 位氨基酸序列为组氨酸，而Nisin Z为天冬氨酸[11]。本研究中所发现的乳酸菌为乳酸乳球菌K6 产细菌素为Nisin Z （数据另刊发表中）。

目前市售的乳酸乳球菌多为Nisin A。由于提纯等技术限制，市售的纯度较低（纯度一般为2.5%），且价格较高。研究如何提高Nisin 的产量十分必要。本研究以具有广谱抑菌效应的乳酸乳球菌K6 为研究对象，通过评估其对金黄色葡萄球菌的半抑制浓度，选取乳酸乳球菌K6 产Nisin Z不同的单因素条件，再利用响应面法优化该菌株产Nisin Z 的条件。旨在获得最佳产细菌素条件，为其大规模产业化应用提供基础数据支持。

1 材料与方法

1.1 菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）DH3022，本研究室-80 ℃保存。

1.2 培养基及试剂

脑心浸出液培养基 （Brain heart infusion broth，BHI 培养基）、MRS 培养基，英国OXOID 公司；M17 培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；盐酸、NaOH、硫酸铵、葡萄糖、乳糖，国药（上海）化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

TG16-WS 离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；2720 Thermal Cycler PCR 仪，上海赛默飞世尔科技公司；Nano drop 2000c 分光光度计，美国thermo 公司；酶标仪Power Wave XS，美国伯腾仪器有限公司；MIR-153 低温恒温培养箱，日本三洋（SANYO）电机公司；超净工作台SEX-TJ，上海整新电子设备；YXQ-LS-50SII 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.4 试验方法

1.4.1 抑菌活性测定及评价 取过夜培养的乳酸乳球菌K6，以2%的接种量接种于BHI 肉汤，30℃条件下静置培养过夜。培养结束后，10 000 r/min离心10 min 去除菌体细胞，调上清液pH 值至6.5左右，100 ℃水浴加热15 min 后置于冰上5 min。以金黄色葡萄球菌为指示菌，取96 微孔板以200 μL 装液量，按照微量稀释法进行测定[12]。根据细菌素效价计算方法确定抑菌活性[13]，其中指示菌的生长抑制率用I 表示，计算公式为I=1-A1/A0；式中，A1——一定量的细菌素和指示菌混合液OD600的吸光值；A0——对照组，即指示菌和等量无菌水混合液的吸光值。通过测定连续稀释浓度，找到ID50（I=0.5），即半抑制浓度（MIC50），半抑制浓度是细菌素在一定时间内能够抑制50%指示菌的用量。

1.4.2 单因素试验设计

1.4.2.1 不同培养基对抑菌效果的影响 以2%的接种量将指标菌乳酸乳球菌K6 分别接种于5 mL 的MRS，BHI，M17，GM17 （含0.5% 的葡萄糖的M17 肉汤），LM17 （含0.5%的乳糖的M17 肉汤）培养基中30 ℃静置过夜培养。培养结束后，按照1.4.1 节方法取样，测定上清液的抑菌活性。

1.4.2.2 不同菌液添加量对抑菌效果的影响 以0.5%，1.0%，2.0%，4.0%和8.0%的接种量将指标菌乳酸乳球菌K6 接种到5 mL 的MRS 肉汤中30℃静置培养过夜。培养结束后，按照1.4.1 节方法取样，测定上清液的抑菌活性。

1.4.2.3 培养基初始pH 值对抑菌效果的影响将5 mL 的MRS 肉汤用0.1 mol/L 的盐酸或10%NaOH 溶液调节初始pH 值至4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 和10.0。以2%接种量加入指标菌乳酸乳球菌K6，30 ℃静置培养过夜。培养结束后，按照1.4.1 节方法取样，测定上清液的抑菌活性。

1.4.2.4 不同培养时间对抑菌效果的影响 在5 mL pH 5.5 的MRS 肉汤中以2%接种量加入指标菌乳酸乳球菌K6，在30 ℃分别培养0，1，2，4，6，8，12 h 和24 h，培养结束后，按照1.4.1 节方法取样，测定上清液的抑菌活性。

1.4.2.5 不同培养温度对抑菌效果的影响 在5 mL pH 5.5 的MRS 肉汤中以2%接种量加入指标菌乳酸乳球菌K6，分别在25，30，35，40 ℃和45℃条件下静置培养12 h，培养结束后，按照1.4.1节方法取样，测定上清液的抑菌活性。

1.4.3 响应面优化试验设计 根据单因素试验结果，选取3 个主要影响因素，每个因素选取个水平，用Minitab 17 中的Box-Behnken 法进行响应面分析，以Nisin Z 抑菌效价为响应值，对试验数据进行多元回归拟合，分析各因素对乳酸乳球菌K6 抑菌活性影响的主效应和交互效应，从而确定乳酸乳球菌K6 最佳条件。以最优组合条件处理3组并测定抑菌活性，比较模型预测值和试验值，以验证模型是否有效。

1.4.4 Nisin Z 抑菌机理 分别在5 mL 和1 L 的pH 7.5 的MRS 肉汤中按0.5%的接种量接种乳酸乳球菌K6，29.8 ℃条件下分别培养9 h 和12 h。培养结束后，前者在10 000 r/min 条件下离心10 min，再在100 ℃条件下水浴15 min，冰上冷却10 min 后备用；后者在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心30 min，去掉沉淀，上清液中按照45%饱和度添加硫酸铵，4 ℃静置12 h 后在4 ℃，10 000 r/min 条件下离心30 min，用无菌水溶解沉淀。两组处理后分别取100 μL 上清液添加到96 孔板中，以BHI 肉汤进行梯度稀释，添加100 μL 稀释至50 倍体积的金黄色葡萄球菌到96 孔板，29.8 ℃条件下培养，每隔一段时间测定OD600nm，以添加等量同浓度的金黄色葡萄球菌和100 μL 的BHI 肉汤相同条件下培养为对照。

2 结果与分析

2.1 乳酸乳球菌K9 产细菌素单因素试验结果

2.1.1 不同培养基对产细菌素的影响 乳酸菌的生长和增殖过程需消耗不同的碳源和氮源。因此乳酸菌细菌素的产生依赖于培养基的组成成分[14]。MRS 培养基是富集培养基，它包含不同的氮源和碳源，为乳酸菌的生长增殖提供充足的养分；BHI 培养基是一种常用的培养基，它可以培养多种微生物，包括细菌、酵母和霉菌[15]。因此，探讨不同营养条件下乳酸菌的生长可以有效判断其细菌素产生的前提条件。乳酸乳球菌K6 在不同培养基培养条件下抑菌效果见图1。从图中可以看出，细菌素在MRS，LM17 肉汤中产量较高，抑菌浓度为2.5 BU/mL，较其它3 种培养条件下的抑菌活性略高。然而，考虑到经济效益和操作方便，MRS 肉汤的价格最为低廉，且该培养基在市场上较为常见，因此选用MRS 肉汤做后续试验。

2.1.2 菌液添加量对产细菌素的影响 菌液添加量可以影响细菌在特定环境下的生长情况。由图2可知，在接种量为0.5%～4%时，对细菌素产量的影响差异不大（MIC50均为2.5 BU/mL），这可能是因为细菌素是菌株生长到一定阶段为适应环境变化而形成的，它的合成受菌体细胞群体感应的影响[16]。当接种量增加到8%，最低抑制浓度反而增大，这说明细菌素的生长量并不随着菌液添加量的增加而增加，这可能由于细菌竞争营养成分从而影响细菌素的产量[17]；试验过程中，不同接种量对抑菌活性的影响较小，因此接种量不作为后期响应面优化考察的主要因素。

图1 不同培养基对Nisin Z 抑菌性质的影响Fig.1 Effects of different broth on the production of Nisin Z against S.aureus

图2 不同菌液添加量对Nisin Z 抑菌性质的影响Fig.2 Effects of inoculation amount on the production of Nisin Z against S.aureus

2.1.3 培养基初始pH 值对产细菌素的影响 乳酸菌在不同的pH 值条件下生长情况不同，因此培养基初始pH 值对细菌素的生长影响较大。当培养基初始pH 5.5～9 时，抑菌效果最好（MIC50为1.25 BU/mL），说明此时的pH 值范围可能适合该细菌的生长；当pH 值低于4.5 时，乳酸乳球菌K6不产生细菌素，这与Leblanc 等[18]的研究结果相似。当培养基初始pH 值高于9 时，未观察到明显的抑制效果，说明此时的pH 值可能对该细菌素的生长造成影响。可能由于在不同pH 值条件下，细菌素的转录翻译过程受到了阻碍或菌体细胞对细菌素的吸附能力不同[19]。根据测定结果以及MRS 肉汤初始pH 值接近于5.5，考虑到操作的方便性，选用初始pH 值为5.5 进行后续试验。

2.1.4 培养时间对产细菌素的影响 细菌素的产生与细菌所处的生长阶段有一定联系。有的细菌素在细菌处于迟缓期就开始产生，有的则在细菌生长的对数期或者稳定期后慢慢产生[20]。由图4可知，乳酸乳杆菌K6 在4 h 后开始检测出抑菌效果，随后细菌素产量逐渐增加，抑菌效果更为明显；培养时间在8～24 h 时，抑菌效果较好（MIC50为1.25 BU/mL）。这可能是由于培养时间过短，菌体生长不完全，因此产生的细菌素产量也少，抑菌效果不明显。培养时间过长，抑菌活性变化不明显，这可能是由于细菌素吸附到产生菌株的细胞表面，从而使得肉汤中细菌素数量减少，造成抑菌活性下降。因此不同培养时间会对细菌素的产量造成影响。本研究中乳酸乳球菌K6 在8 h 后产生细菌素的效果明显，因此选择培养时间为8 h 进行后续试验。

图3 初始pH 值对Nisin Z 抑菌性质的影响Fig.3 Effects of initial pH value on the production of Nisin Z against S.aureus

图4 培养时间对Nisin Z 抑菌性质的影响Fig.4 Effects of culture time on the production of Nisin Z against S.aureus

2.1.5 培养温度对产细菌素的影响 乳酸菌产细菌素有时也受温度调控影响，其对培养温度变化十分敏感[21]。由图5可知，在25～35 ℃条件下培养，细菌素抑菌活性较高，这与大部分乳酸乳球菌产细菌素适宜温度相近[22]，随着温度的继续升高，抑菌活性降低，说明细菌素产量明显下降，甚至受到抑制。考虑到培养温度过低，乳酸菌生长可能会变缓或者生长不完全，影响到细菌素的产生，因此选择30 ℃进行后续试验。

图5 培养温度对Nisin Z 抑菌性质的影响Fig.5 Effects of temperature on the production of Nisin Z against S.aureus

2.2 响应面试验优化产细菌素的培养条件

2.2.1 响应面试验结果与分析 根据单因素试验结果，以及Box-Behnken 中心组合试验设计原理[23-24]。以培养时间、培养温度和培养基初始pH值3 个因素做试验设计 （见表1）。本研究利用Minitab 17 软件对结果进行回归分析并绘制响应面，以MIC50为响应值进行多次拟合（见表2和图6），通过Minitab 17 软件对响应面进行优化分析后，得到最佳条件为：A=-1.0，B=0.17，C=1.0。即培养时间为9 h，培养温度为29.83 ℃，培养基初始pH 值为7.5。得到的回归方程y=1.500+0.234A+0.625B-0.391C-0.203A2+1.828B2-0.203C2+0.625AB-0.156AC-0.625BC。该条件下MIC50预测值为0.6435 BU/mL。

由表3的方差分析结果可知，回归模型的相关系数R2=0.8840，说明回归方程中的自变量和因变量之间线性关系显著，且P回归<0.01，P失拟>0.05，说明建立的回归模型可靠，预测值和实际值有很好的拟合度。因此，此模型可用于分析和预测菌株K6 产细菌素水平。在因素的选择水平范围内，B2< 0.01，说明培养温度对细菌素产量影响显著。

表1 响应面因素与水平表设计Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

表2 响应面试验设计及试验结果Table 2 Design matrix and experiment results of response surface method

表3 回归方程的方差分析结果Table 3 Results of analysis of variance on the established regression model

2.2.2 响应面分析及最佳培养条件确定 图6分别表示了影响菌株K6 产细菌素的培养温度、培养时间和培养基初始pH 值3 个因素两两交互作用。从图中可以看出，培养温度对细菌素产量的影响起显著性作用，培养时间和培养基初始pH 值对细菌素产量也有一定影响。结合实际操作条件，将培养条件调整为培养时间9 h，培养温度29.8℃，培养基初始pH 值为7.5。为进一步验证模型的可靠性，在优化后的条件下做3 次重复试验，验证得到细菌素实际MIC50的平均值为0.625 BU/mL，与预测值拟合率达97.13%，即拟合性良好，此优化模型可靠。同时，优化后细菌素抑菌活性（0.625 BU/mL）比优化前细菌素抑菌活性（2.5 BU/mL）提高了8 倍，说明本试验所设计的优化方案合理，得到的培养条件能够明显提高菌株K6 细菌素产量。另外，该响应模型得到的响应面和等值线图中极大值点/极小值点并不显著，可能由于本试验只优化了培养条件，而并没有考虑培养基成分的影响，可能还存在部分显著因素未纳入其中。因此，后续试验还需要进一步优化培养基和培养条件，对其中的显著因素再加以考查，以确定各因素间的交互作用以及产细菌素的最优方案，为实际应用提供一定的理论依据。

图6 最低抑制浓度的响应面及等值线Fig.6 Response surface and contour of the minimal inhibitory concentration

2.3 Nisin Z 抑菌机理

不同乳酸菌细菌素的抑菌方式主要分为有完全杀灭（bacteriocide）和阻止生长（bacteriostatic）两种。Nisin 作为研究比较广泛的乳酸菌细菌素，其主要抑菌作用是通过N-末端靶向链接脂质II（lipid II），从而传递抑菌活性[25]。图7是Nisin Z对金黄色葡萄球菌的抑制情况。试验结果表明，对照组在1.5 h 后开始生长，在2 h 后添加上清液对金黄色葡萄球菌抑制作用不再明显，金黄色葡萄球菌开始缓慢生长，2.5 h 后开始进入指数生长期。然而添加上清液仍对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。相较而言，经浓缩后的Nisin Z 对金黄色葡萄球菌有完全抑制作用，说明Nisin Z 对金黄色葡萄球菌的抑菌方式为完全杀灭。这一结果充分证明了乳酸菌细菌素是通过锚定细菌细胞膜上的特定蛋白作为受体，作用于细胞膜从而形成核结构，造成细菌死亡的理论。

图7 细菌素对金黄色葡萄球菌抑菌机理Fig.7 Model of action of bacteriocin produced by Lactococcus lactics K6 against S.aureus

3 结论

本研究选用贻贝中筛选分离出来具有广谱抑菌效果的Nisin Z，通过分析单因素对其抑菌效果的影响，确定培养时间、培养基初始pH 值和培养温度为主要因素，利用响应面法优化乳酸乳球菌K6 产Nisin Z 的条件。通过优化得到乳酸乳球菌K6 以0.5%的接种量，在培养温度为29.8 ℃、培养基初始pH 值为7.5 的条件下培养9 h，抑菌性质最好，即细菌素产量较高。在最佳培养条件下，得到的回归方程y=1.500+0.234A+0.625B-0.391C-0.203A2+1.828B2-0.203C2+0.625AB-0.156AC-0.625BC。优化后的MIC50平均值为0.625 BU/mL，较优化前细菌素浓度MIC50提高了8 倍。优化后的MIC50与理论值0.6435 BU/mL 接近，说明该回归模型能够较真实地反映各因素对乳酸乳球菌K6 所产细菌素产量的显著影响，建立的模型与实际情况基本吻合，即该响应模型具有一定的可靠性，可应用于乳酸乳球菌K6 生长条件优化，因此有一定的应用价值。