混合溶液中茶多酚、植酸含量的分光光度法测定及干扰消除

张 璇 李秋莹 钟克利 孙 彤* 杨丽丽 韩 英 励建荣

（1 生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州121013 2 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省食品安全重点实验室 辽宁锦州121013 3 渤海大学化学化工学院 辽宁锦州121013）

我国的水产品产量大、种类多，水产品总产量已连续20 多年位居世界首位[1]。然而，水产品易在物理、化学、微生物等方面发生变化，在贮运、加工和销售过程中变色、变味，使食品失去鲜度甚至腐败变质[2]。水产品保鲜具有十分重要的现实意义[3]。目前，水产品保鲜方式可分为2 类：一是采用气调[4]、低温[5]、辐照[6]、超高压[7]等方式，因其投资大，成本高，需要设备多，而不适合小批量产品；二是采用保鲜剂处理，该方法作为食品贮藏加工的有效辅助手段，发挥着十分重要的作用[8]。其中对于水产品保鲜更趋于采用不同来源的保鲜剂综合运用的方法，以利于发挥其协同效应，这样不仅可以增强其抑菌性能，还可以提高其应用的安全性[9]。

茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶叶中所含的一类多羟基酚类化合物的总称，有良好的抗氧化和抑菌性能，能有效抑制微生物生长，延缓脂肪氧化，延长水产品的货架期[10]。茶多酚中最重要成分是黄烷醇类的多种儿茶素（catechins），占总酚含量的60%～80%，它是抗氧化的主要成分[11]。植酸（Phytic acid，又称肌醇六磷酸）可作为抗氧化剂、保鲜剂、水的软化剂、金属防腐蚀剂等，广泛应用于食品、医药及高分子工业等行业领域。植酸可降低水产品的pH 值，络合金属离子，抑制氧化和褐变，从而起到保鲜的作用，且对革兰氏阴性菌有显著的抑制作用[12]。茶多酚与植酸均为食品保鲜剂，复合使用有助于发挥其协同作用。

研究茶多酚和植酸的协同保鲜性能时，混合物质中2 种组分含量的准确测定是工作开展的前提。目前，对混合溶液浓度同时测定的方法主要为液相色谱法[13]，然而，该方法对仪器的要求较高。茶多酚和植酸均可采用显色后分光光度法测定，且混合物的双波长分光光度法应用较为广泛[14]。研究表明，植酸对混合溶液中茶多酚浓度测定的结果无影响，而茶多酚含量可影响植酸显色后的摩尔吸光系数，进而严重影响其测定结果的准确度。寻找一种简单、准确，可同时测定混合溶液中茶多酚、植酸浓度的方法十分必要。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

茶多酚（食品级），安徽红星药业有限公司；植酸、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、三氯化铁、磺基水杨酸等均为分析纯级；去离子水自制。

MS 105DU 电子分析天平，梅特勒托利多仪器有限公司（瑞士）；Victor X3 酶标仪，美国珀金埃尔默公司（Perkin Elmer）。

1.2 试验方法

显色法测定茶多酚浓度：参照GB/T 8313-2002，茶、茶多酚测定[15]。酒石酸亚铁溶液配制：称取0.1000 g 硫酸亚铁和0.5000 g 酒石酸钾钠，加水溶解并定容100 mL。分别准确吸取质量浓度为0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg/mL的茶多酚溶液200 μL 置于24 孔板中，加入1.000 mL 酒石酸亚铁溶液，1.500 mL pH 7.5 磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L），用酶标仪测定波长490 nm 处溶液的吸光度，并绘制标准曲线。

显色法测定植酸浓度：参照GB/T 5009.153-2016，食品中植酸的测定[16]。三氯化铁-磺基水杨酸溶液配制：称取1.5000 g 三氯化铁和15.0000 g磺基水杨酸，加水溶解并定容500 mL，使用前用水稀释15 倍。分别准确吸取质量浓度为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL 的植酸溶液100 μL 于24 孔板中，再加入2.000 mL 三氯化铁-磺基水杨酸反应溶液，用酶标仪测定波长490 nm 处溶液的吸光度，并绘制标准曲线。

同样方法测定茶多酚和植酸待测液的吸光度，计算各组分质量浓度。

2 结果与分析

2.1 茶多酚、植酸混合溶液中茶多酚质量浓度的测定

茶多酚类物质能与Fe2+定量形成紫蓝色络合物，可以用酒石酸亚铁显色，采用分光光度法测定其含量[15]。用酒石酸亚铁显色法处理梯度质量浓度的茶多酚溶液、植酸溶液和含有定量植酸的茶多酚溶液后，测定其标准曲线，如图1所示。由图可见，梯度质量浓度植酸溶液的吸光度均接近于0，即植酸在酒石酸亚铁溶液中不显色，未与Fe2+定量形成紫蓝色络合物（图1a）。而茶多酚质量浓度与溶液吸光度成正比，即与Fe2+定量形成了紫蓝色络合物（图1b）。当茶多酚标准溶液中均含有0.5 mg/mL 植酸时，其标准曲线并未出现偏离（图1b，1c），说明混合溶液中的植酸未干扰茶多酚显色，即植酸不干扰酒石酸亚铁显色法测定茶多酚质量浓度。茶多酚主要成份是表儿茶素和表没食子儿茶素类，儿茶素结构中羟基在苯环上的位置不同，既有邻苯二羟基，又有连苯三羟基，还有没食子酸形成的酯类衍生物。酒石酸亚铁主要与茶多酚中的邻位二羟基和连三羟基反应而显色，而对间位羟基和单羟基不显色[17]。而植酸结构中没有邻位二羟基，故植酸不能与酒石酸亚铁定量显色，进而不会干扰茶多酚质量浓度的测定。

图1 酒石酸亚铁显色法测定茶多酚、植酸及其混合溶液的标准曲线Fig.1 Standard curve of tea polyphenols，phytic acid and their mixed solution by ferrous tartrate coloration method

2.2 茶多酚、植酸混合溶液中植酸质量浓度的测定

采用三氯化铁-磺基水杨酸显色法处理植酸标准溶液和含有一定质量浓度茶多酚的植酸标准溶液，并测定其吸光度，绘制标准曲线，如图2所示。当溶液中不含茶多酚时，植酸与三氯化铁-磺基水杨酸混合液中Fe3+反应，使混合溶液产生褪色反应，植酸含量即与褪色程度成正比。而加入茶多酚后，植酸的标准曲线发生了偏移，溶液的吸光度降低，说明茶多酚也与Fe3+作用，产生了褪色反应，进而干扰植酸质量浓度的测定。由图2可见，溶液中茶多酚质量浓度较低时，植酸的褪色能力较强，随着茶多酚质量浓度增加，植酸标准曲线的斜率（绝对值）减小，说明茶多酚质量浓度增加使植酸的褪色能力减弱。此外，当植酸质量浓度较小时，茶多酚使溶液吸光度下降程度较大，而植酸质量浓度较大时，同样数量的茶多酚使溶液吸光度降低程度较小，说明较多的植酸使茶多酚的褪色能力减弱。分析认为，在三氯化铁-磺基水杨酸显色体系内，磺基水杨酸的酚羟基与Fe3+在波长490 nm 附近形成了具有较大摩尔吸光系数的配合物。当将此显色剂加入植酸溶液中时，植酸中的磷酸根与Fe3+形成配位键，使磺基水杨酸与Fe3+形成的部分配合物解离，溶液的吸光度降低。同理，将此显色剂加入茶多酚溶液中时，茶多酚中的酚羟基与Fe3+形成配位键，使磺基水杨酸与Fe3+形成的部分配合物解离，溶液的吸光度降低。而当溶液中同时存在茶多酚和植酸时，植酸中的磷酸根与茶多酚中的酚羟基形成氢键，使裸露的磷酸根和酚羟基减少，减弱了其与Fe3+形成配位键的能力，表现为溶液褪色能力降低。为消除茶多酚对植酸浓度测定的干扰，将上述标准曲线进行线性模拟，结果如表1所示。

图2 不同质量浓度茶多酚混合溶液中植酸的标准曲线Fig.2 Standard curve of phytic acid solution with different mass concentration of tea polyphenols

表1 不同浓度茶多酚混合溶液中的植酸标准曲线方程Table 1 The linear regression equation of phytic acid with different concentrations of tea polyphenols in mixed solutions

由表1可见，各标准曲线的相关系数均达0.99 以上，说明植酸浓度与溶液吸光度呈线性关系。而混合溶液中茶多酚的质量浓度对植酸标准曲线方程的斜率和截距均有影响。以茶多酚质量浓度为横坐标，植酸标准曲线方程的k，b 为纵坐标绘图（图3），可见茶多酚质量浓度与线性方程截距和斜率不存在线性关系。分别采用二次和三次多项式模拟该曲线，结果见表2。

研究结果表明，采用三次多项式模拟茶多酚质量浓度与k 值的关系时，其相关系数大于0.99，说明可用方程k=1.0522c3-0.3044c2+0.0938c-0.3319 描述两者之间的关系。同理，可用二次多项式b=-0.76c2-0.2165c+1.4612 或三次多项式b=-2.8348c3+0.5157c2-0.3539c+1.4623 描述茶多酚质量浓度与b 值的关系。

2.3 回收试验

准确配制已知质量浓度的茶多酚和植酸混合溶液，采用酒石酸亚铁显色法测定混合溶液中茶多酚的质量浓度c，将其带入k=1.0522c3-0.3044c2+0.0938c-0.3319 和b=-0.76c2-0.2165c+1.4612中，计算k、b 值，得植酸标准曲线。采用三氯化铁-磺基水杨酸显色法测定混合溶液的吸光度，计算混合溶液中植酸的质量浓度，计算其回收率，结果如表3所示。

图3 茶多酚质量浓度与混合溶液中植酸标准曲线的斜率（a）、截距（b）的关系Fig.3 The relationship between the concentration of tea polyphenols and the slope （a），intercept （b）of the phytic acid standard curve

表2 k、b 值的模拟方程Table 2 The simulation equations for k and b values

表3 混合溶液中茶多酚和植酸浓度测定结果Table 3 The measurement results of concentration of tea polyphenols and phytic acid in mixed solution

结果表明，采用酒石酸亚铁显色结合三氯化铁-磺基水杨酸显色法同时测定茶多酚和植酸混合溶液中的各组分含量，茶多酚的测定回收率为97.50%～102.50%，植酸的测定回收率为96.36%～102.24%，测定误差不超过±4%，说明该方法准确度较高，可用于测定混合溶液中茶多酚和植酸的含量。

3 结论

本文采用分光光度法同时测定混合溶液中茶多酚和植酸的质量浓度。结果表明，混合溶液中茶多酚的质量浓度可采用酒石酸亚铁显色法测定，植酸对测定结果无干扰；混合溶液中植酸的质量浓度可采用三氯化铁-磺基水杨酸显色法，而茶多酚对其显色能力有影响。可采用数学拟合法获得在一定茶多酚质量浓度时，混合溶液中植酸的标准曲线，进而测定混合溶液中植酸的质量浓度。该方法检测最佳范围为茶多酚质量浓度0～0.300 mg/mL，植酸质量浓度0～3.000 mg/mL。采用该方法测定混合溶液中茶多酚和植酸的质量浓度，回收率为96%～103%，测定误差不超过±4%，准确度高，具有广泛的应用价值。