GC-MS/MS 法同时分析烟叶中42 种有机酸

王 冰，余晶晶，蔡君兰，郭吉兆，邹西梅，李小兰，崔华鹏，张晓兵，刘绍峰，谢顺萍，吴晶晶*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 广西中烟工业有限责任公司，南宁市西乡塘区北湖南路28 号 530001

3. 贵州中烟工业有限责任公司，贵阳市小河区开发大道96 号 550000

烟草中有机酸可分为脂肪酸和非脂肪酸。各短链及长链脂肪酸由于其挥发、半挥发性及其特征香气和本身的酸性，对卷烟香气质量如卷烟的劲头、刺激性等产生显著影响［1-3］。而非脂肪类有机酸（羟基酸、氧代酸、芳香酸等），也具有特征的香气和吃味；例如，乳酸具有奶香味，能使烟气更柔顺醇和；4-氧代壬酸具有刺激的、辛辣的味道，能增加烟气丰满度；苯甲酸表现为弱的、淡的醇和香味；肉桂酸具有和顺的、醇和的，微弱的香脂香味等［4-5］。因此，研究烟叶中有机酸的种类和含量对了解烟草的感官品质和改进卷烟配方具有重要的价值和意义。目前国内外关于有机酸定性定量的方法较多，主要有离子色谱法［6-8］、毛细管电泳法［9-11］、液相色谱法［12-13］、气相色谱法等［14-17］。离子色谱、毛细管电泳、液相色谱法基本用于含量高的多元酸和多羟基酸的分析。在气相色谱法中，由于前处理中应用了甲酯化、硅烷化等衍生方法，基本能分析挥发性酸及半挥发性酸，但是，对于烟叶中含量低的挥发性脂肪酸（如：异丁酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、2-辛烯酸等），高级脂肪酸（十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸）及其他非脂肪有机酸（如4-氧代壬酸、肉桂酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸等），由于受仪器灵敏度的限制及杂质干扰影响，均难以准确定量。近年来，串联质谱由于其更高的选择性和灵敏度被用于农药［18］、代谢物［19］等分析研究工作中，2014 年，Lin 等［20］应用GC-MS/MS 对烟叶中的有机酸进行了分析,由于样品没有经过衍生化，目标物仅包含个别挥发酸及部分高级脂肪酸，且峰形拖尾。本研究中基于GC-MS/MS 技术，建立了硅烷化衍生同时检测烟叶中42 种有机酸的方法，旨在为烟叶有机酸高通量分析提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

选择4 种类型烟叶（烤烟、白肋烟、香料烟、晒红烟）样品。其中烤烟样本又包括清香型、中间香型、浓香型样品。实验样品共计16 个，其信息见表1。

甲酸、乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、巴豆酸、异戊酸、戊酸、异戊烯酸、惕各酸、己酸、庚酸、辛酸、癸酸、十七酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、十九酸、二十酸（纯度均＞98.0%，加拿大TRC 公司）；3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、2-辛烯酸、壬酸、反-2-己烯酸、十一酸、十二酸、十四酸、12-甲基十四烷酸、十六酸（纯度均＞98.0%，北京百灵威公司）；乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸（＞98.0%，美国Sigma Aldrich 公司）；二氯甲烷（色谱纯，美国Acros Organics 公司）；磷酸（分析纯，天津科密欧试剂开发中心）；N,O-双（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，美国 Sigma Aldrich 公司）。

TRACE 1310／TSQ QUANTUM XLS 气 相 色谱/串联质谱联用仪（GC-MS/MS，美国Thermo Scientific 公司）；CP224S 电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）；Advanced Multi-Tube Vortexer数显型涡旋仪（美国Talboys 公司）；702 SM Titrino pH 计（瑞士Metrohm 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

分别称取42 种一定量的有机酸标品于10 mL容量瓶中，配制单标母液。取一定量的各单标母液于10 mL 容量瓶中，配制混标母液。梯度取混标母液于7 个10 mL 容量瓶中，配制7 级混标，制作标准曲线。采用反-2-己烯酸为内标，内标质量浓度为0.5 µg/mL。

表1 样品信息Tab.1 Leaf sample information

1.2.2 样品处理及分析

pH 调节溶液配制：将 60 g NaH2PO4·2H2O 溶于 90 mL 水中，再加入 9.5 g 85% H3PO4配成泡发液。

萃取及衍生化：称取烟粉2 g，加入2 mL pH调节溶液，细玻棒搅拌后，用1 mL pH 调节溶液淋洗玻棒，使烟粉充分浸润。加入75 μ g/mL 的反-2-己烯酸内标溶液100 μL，泡发30 min，此时体系pH 约为2.5。加入15 mL 二氯甲烷萃取液，于2 500 r/min 下涡旋20 min，静置，过有机相滤膜。取滤液1 mL，加入BSTFA 衍生化试剂150 μL，拧紧密封盖后摇匀，于60 ℃下衍生40 min，样品冷却至室温，进GC-MS/MS 分析。分析条件如下：

色谱柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm id×0.25 μm df）毛细管柱；进样口温度：280 ℃；载气：He（＞99.999%），流速1.0 mL/min；程序升温：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min 升至 280 ℃并保持20 min；进样量：1.0 μL，分流比10∶1；传输线温度：280 ℃；电离（EI）能量：70 eV；离子源温度：300 ℃；四极杆温度：180 ℃；电子倍增器电压：1.491 kV；扫描方式：SIM 和SCAN；质量扫描范围：50～400 amu；监测方式：多反应监测（MRM）。42 种化合物质谱采集参数见表2。

1.2.3 数据处理

采用标样对照，NIST98 谱库检索方法定性，内标工作曲线法定量。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 质谱条件的确定

通过对500 ng/mL 混标溶液一级全扫描，选取信号响应较高且基质无干扰的特征离子为母离子。以母离子为前体离子，进行产物离子扫描，选取信号响应高，基质无干扰的离子为子离子。每种化合物选取两对离子对，分别为定性定量离子对，依次加以 5、10、15、20、25 和 30 eV 碰撞能，选取离子对响应最高的碰撞能。优化好的定性定量离子对及相应的碰撞能量如表2 所示。通过色谱分离及串联质谱的进一步降噪，提高了方法的灵敏度及选择性，实现了42 种有机酸的同时准确定量。代表性有机酸在串联质谱与一级质谱上的响应比较如图1 所示：在一级质谱上无法准确定量的8 种化合物（异丁酸、4-氧代壬酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸、丙酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、肉桂酸）在串联质谱上均能准确定量。

2.1.2 前处理条件的确定

选取代表性酸性成分甲酸、乙酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、十六酸、亚油酸、乳酸、苯甲酸进行前处理条件的优化。分别对泡发烟叶pH（5.4、4.4、3.9、3.4、2.9、2.5、2.0）、涡旋萃取时间（5、10、15、20、25 min）、衍生温度（室温、60 ℃）、衍生时间（10、20、30、40、50 min）、衍生化试剂用量（50、100、150、200、250、300 µL）条件进行了考察。确定将泡发烟叶体系pH 调整至2.5，萃取20 min 后，取 1 mL 上清液加入 150 μL BSTFA 于 60 ℃衍生40 min 为前处理条件。按每组实验数据最大值归一化结果作图，结果见图2。

表2 42 种有机酸保留时间及质谱参数Tab.2 RT and MS parameters for 42 organic acids

图1 代表性化合物串联质谱与一级质谱离子流图比较Fig.1 Comparison of ion current diagrams by MS-MS and MS of representative compounds

图2 前处理条件优化结果Fig.2 Optimized pretreatment conditions

2.2 方法评价

2.2.1 标准曲线、检出限及定量限

以各目标物与内标物的离子对响应面积比为纵坐标，浓度（ng/mL）为横坐标作图，得到标准工作曲线。分别以3 倍和10 倍信噪比（S/N）确定检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果（表3）显示，目标物的线性关系良好，可以满足定量分析要求。

2.2.2 方法精密度及回收率

选取典型烤烟样品，一天内进行5 平行实验以考察方法日内精密度，对所选样品连续5 天进行实验以考察方法日间精密度。以实际样品含量为参考，根据所对应的酸在烟末中含量的0.5、1、2 倍进行低、中、高加标回收率实验。结果表明：各目标酸性成分平均回收率为76%～110%，日内、日间精密度（除3-甲基戊酸、4-甲基戊酸、癸酸外）均小于10%。

2.3 样品分析

采用所建立的方法对12 个烤烟C3F 样品（清香型烤烟4 个，中间香型烤烟4 个，浓香型烤烟4个），2 个白肋烟样品，1 个香料烟和1 个晒红烟样品进行测定，具体样品信息见表1。

2.3.1 3 种香型烤烟之间酸性成分差异分析

对清香型、中间香、浓香型烤烟的测定结果分别求平均值后进行比较分析，筛选出不同香型间差异性酸性成分21 种，对每种目标物进行最大值归一化作图。结果（表4、图3）显示：①3 种香型烤烟中差异性大的酸性成分主要是C5～C8碳链脂肪酸（0.1～2 µg/g）、芳香酸（2～6 µg/g）、羟基酸（1～7µg/g）及氧代酸（0.05～0.8 µg/g），高级脂肪酸仅需关注十四酸（15～22 µg/g）和亚麻酸（300～500 µg/g）。②C5～C8中碳链直链脂肪酸（戊酸、己酸、庚酸、辛酸）、芳香酸（苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、2-羟基苯甲酸）及十四酸、惕各酸在浓香型烟叶中含量显著高于清香型及中间香型烟叶；4-甲基戊酸含量显著低于清香型及中间香型烟叶。③异戊酸、3-甲基戊酸，短链羟基酸（3-羟基丙酸、乳酸）及亚麻酸、2-呋喃甲酸在中间香型烤烟中含量显著高于浓香型和清香型。④清香型烤烟中4-氧代壬酸、2-甲氧基苯甲酸含量最高。

2.3.2 不同类型烟叶之间酸性成分差异分析

比较分析烤烟（取均值）、白肋烟（取均值）、香料烟、晒红烟的测定结果，筛选出不同类型烟叶间差异性酸性成分34 种，对每种化合物进行最大值归一化作图。结果（表5、图4）显示：①大多数低级、高级脂肪酸及羟基酸、氧代酸在香料烟中含量最高，在烤烟中含量最低，白肋烟及晒红烟中的含量居中。②代表性芳香酸如苯甲酸、苯乙酸及异戊酸和巴豆酸在白肋烟中含量最高，远高于在其他3 种类型烟叶中的含量。③以往未检出的2-辛烯酸、2-甲氧基苯甲酸在晒红烟中含量最高。

表3 42 种目标物的线性方程、回收率、RSD（n=5）和检出限Tab.3 Linear equations, spiked recoveries, RSD（n=5）and limits of detection of 42 organic acids

表4 3 种香型烤烟中21 种酸性成分含量Tab.4 Contents of 21 organic acids in flue-cured tobacco of 3 flavor types （μg·g-1）

图3 3 种香型烤烟中21 种有机酸含量雷达图Fig.3 Radar diagram displaying the contents of 21 organic acids in flue-cured tobacco of 3 flavor types

表5 4 种类型烟叶中34 种酸性成分含量Tab.5 Contents of 34 organic acids in 4 types of tobacco （μg·g-1）

图4 4 种类型烟叶中34 种有机酸含量雷达图Fig.4 Radar diagram displaying the contents of 34 organic acids in 4 types of tobacco

3 结论

建立了基于硅烷化-GC-MS/MS 技术的烟叶中有机酸分析方法，本方法可分析的目标化合物多，涵盖了C1～C20脂肪酸、羟基酸、芳香酸、氧代酸等，本研究中共定量分析了烟草中的42 种有机酸。本方法精密度好，准确度高，操作简单。与一级质谱检测方法相比，本方法灵敏度与选择性大幅提高，对于在一级质谱上检测不到的目标物（如：异丁酸、4-氧代壬酸、3-苯基丙酸、2-甲氧基苯甲酸）、有干扰不能进行准确定量的目标物（如：丙酸、巴豆酸、4-甲基戊酸、肉桂酸）及含量较低的酸性成分（如：2-辛烯酸、十一酸、12-甲基十四烷酸、十七酸、二十酸等），均可准确定量。本方法可用于研究不同类型及同一类型不同香型烟叶中的有机酸。