多波长HPLC结合化学模式识别的漳州陈皮炮制品质量比较研究

陈育青， 朱善岚， 黄红宣， 杨成梓 ， 吕大伟, 王小平

陈皮(Citri Reticulatae Pericarpium)别称橘皮，为芸香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果实的果皮，最早记载见于《神农本草经》，其味苦、辛，性温，归肺、脾经，其功效为理气健脾，燥湿化痰，主治脘腹胀满，食少吐泻、咳嗽痰多等症[1]。陈皮主要含有黄酮和挥发油两类成分，具有抗炎、保肝、降压、降血脂、抗氧化等作用。橙皮苷、川橙皮素、橙皮素和柚皮苷等为陈皮黄酮类的主成分，其中前3种是陈皮重要的活性成分，含量较高，具有较强的抗氧化和抗癌活性[2-6]。陈皮炮制有炒制、醋炙、焙制、麸制、黑豆制、盐炙、制炭、巴豆炒、酒浸、米泔水浸、熬法制、米制、米炒、面炒、姜汁炒、童便制、土炒、香附炒制、蜜炙等20种方法[7]。《福建省中药炮制规范》(2012年版)收载生品、盐制、制陈皮。2015年版《中华人民共和国国药典》陈皮仅收载生品入药。

福建省漳州市作为闽南中药炮制技术的代表，有着悠久的历史。《漳州市常用中药加工炮制法》中收载四制陈皮，炮制技术独特，具有闽南特色。漳州四制陈皮分别采用甘草水、醋、姜、盐等四种辅料炮制，其中甘草水制治火痰、姜汁炙治寒痰、盐炙治燥痰、醋炙治郁痰；经四制后可引药入肝、下焦，且使其温而不燥，不仅增强其理气开胃、降气化痰作用，同时兼具行气解郁之功[8]。不同炮制品陈皮功效有所侧重，如麸炒陈皮侧重醒脾温胃，土炒陈皮侧重化痰止呕。本研究采用多波长高效液相色谱法测定四制陈皮、蒸陈皮、生品陈皮等不同炮制方法中橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的含量，对不同炮制品陈皮黄酮类成分含量差异性进行比较，阐明漳州四制陈皮的品质特色，为后续炮制工艺及炮制原理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

1.1.1试剂 橙皮苷标准品(批号：MUST-18032502)、橙皮素标准品(批号：MUST-18040804)和川陈皮素标准品(批号：MUST-18042205)均购自成都曼斯特生物科技有限公司。HPLC用乙腈为色谱纯，其余试剂皆为分析纯。

1.1.2仪器 高效液相色谱仪(Agilent1260，美国安捷伦公司)，电子分析天平(AB265-S型，瑞士梅特勒-托利多公司)，精密型超纯水机(FST-Ⅲ-10，上海富诗特公司)和超声波清洗器(KQ5200，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1炮制样品制备

1.2.1.1四制陈皮的制备 生陈皮购自福建漳州市长泰县，经笔者医院中药教研室鉴定为芸香科植物橘Citrus Reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。原药拣去杂质洗净，晒干。按每100 kg陈皮配甘草5 kg、生姜5 kg、食盐5 kg和醋5 kg，四味煎汤去渣，投入净陈皮熬至药汤吸尽为度，捞起晒干即成[8]。

1.2.1.2其他陈皮炮制样品制备 蒸陈皮：取陈皮，除去杂质，湿润后，蒸透，取出，切丝，低温干燥[9]。炒陈皮：取净陈皮丝，文火炒至深黄色，取出，放凉[10]。麸炒陈皮：取净陈皮丝，用麸皮拌炒至内表面呈黄色，筛去麸皮晾干[11]。土炒陈皮：将锅用文火加热，放入灶心土细粉，待翻动土粉呈较轻松状态时，倒入净陈皮丝，翻炒至表面挂匀土粉，微带焦斑时，及时取出，筛去土粉，晾干[12]。蜜陈皮：每100 kg 陈皮用炼蜜19 kg[13]，取炼蜜加适量开水稀释，加入净陈皮拌匀，闷透，置锅内，用文火加热，炒至老黄色不粘手时，出锅，晾干。盐陈皮：净陈皮100 kg，用食盐3 kg[14]，将食盐加适量水化开，倒入净陈皮拌匀，稍闷润，置锅内，用文火加热炒至色泽变深，出锅，晾干。醋陈皮：每1 kg陈皮饮片用醋200 g[15]，取陈皮饮片，置容器内，加醋拌匀，闷润，吸尽，用文火炒至外表面呈黄褐色至棕褐色，略有焦斑，取出，晾干(性状特征见表1)。

1.2.2溶液配制

1.2.2.1混合对照品溶液的配制 以甲醇为溶剂，按每毫升含195 μg橙皮苷、185 μg橙皮素和198 μg川陈皮素配制混合对照品储备溶液。

1.2.2.2供试品溶液的配制 分别取不同炮制品陈皮适量，粉碎后过60目，称取各粉末0.5 g，加甲醇定容至50 mL，密封，超声处理30 min(200 W功率和40 kHz频率)，置冷，混匀后过滤，即得供试品溶液。

1.2.3色谱条件 色谱柱：Inertsustain C18柱(5 μm，4.6×150 mm)；流动相：0.1%磷酸水-乙腈溶液，梯度洗脱(0～6 min：23% C→28% C，6～19 min：28% C→35% C，19～30 min：35% C→45% C)；流速：1.0 mL/min；检测波长：283 nm(0～6 min，橙皮苷)、283 nm(6～19 min，橙皮素)、334 nm(19～30 min，川陈皮素)；柱温：35 ℃。

表1 陈皮不同炮制品性状特征及炮制依据

2 结 果

2.1测定 取混合对照品溶液适当稀释，分别吸取稀释液与供试品溶液20 μL，注入色谱仪进行分析，记录色谱图。结果见图1。在该色谱条件下，橙皮苷、橙皮素和川陈皮素的保留时间分别为5.133，16.758，25.546 min，与相邻色谱峰均能达到基线分离，峰形良好，且保留时间与色谱分析时间适宜。生陈皮与炮制品陈皮的指纹图谱区别明显，表明其成分发生改变。四制陈皮在保留时间7～9 min时间段，3个色谱峰消失；陈皮生品在保留时间12～13 min 时间段有2个色谱峰，其余炮制品均未见色谱峰；仅四制陈皮、蒸陈皮、清炒陈皮、土炒陈皮检出橙皮素色谱峰，但后三者峰信号极弱。

2.2线性关系分析 分别精密吸取2.2.1项下各混合对照品溶液适量，加甲醇进行逐次稀释，得到系列浓度的标准工作溶液，按2.1项下色谱条件进样检测分析，以样品浓度X(mg/g)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：

橙皮苷：Y=143 866X-9 876，r2=0.999 6

橙皮素：Y=562 973X+7 661，r2=0.999 9

川陈皮素：Y=388 335X-22 709，r2=0.999 7

结果表明，橙皮苷在1.950～78.00 mg/g、橙皮素在0.370～14.80 mg/g、川陈皮素在0.396～15.84 mg/g 范围内样品浓度与峰面积呈良好线性关系。

2.3精密度试验 量取20 μL相同浓度的混合对照品溶液，进样测定，重复5次。色谱图记录结果显示橙皮苷、橙皮素和川陈皮素峰面积的RSD分别为0.61%，0.58%及0.60%，表明仪器精密度良好。

2.4稳定性试验 精密称取四制陈皮样品0.5 g，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，于室温放置0，2，4，8，16 和24 h后分别取样测定，结果显示橙皮苷、橙皮素和川陈皮素峰面积的RSD分别为0.77%，0.95%和0.82%，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.5重复性试验 精密称取四制陈皮样品0.5 g 5份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果按干燥品计算，样品中橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的平均质量分数分别为77.022 mg/g(RSD=1.87%),0.434 mg/g(RSD=2.63%)和6.684 mg/g(RSD=2.00%)。

2.6加样回收率试验 称取已知含量的四制陈皮样品0.25 g，共 6份，每份分别精密加入每1 mL含橙皮苷、橙皮素和川陈皮素为9.75，185和1.98 mg的混合对照品溶液1 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果表明，橙皮苷、橙皮素和川陈皮素平均回收率分别为97.82%(RSD=1.94%)，101.59%(RSD=1.87%)和98.83%(RSD=1.81%)。

2.7样品含量测定 分别精密称取不同炮制方法陈皮样品，按照2.2.2项下方法配制供试品溶液，依法测定。用外标法，按干燥品计算样品中橙皮苷、橙皮素和川陈皮素的平均质量分数。结果见表2。

表2 不同陈皮炮制品中橙皮苷、橙皮素、川陈皮素含量测定

由表2可知，不同炮制品中橙皮苷的含量有差异，依含量高低依次为：四制陈皮>蒸陈皮>麸炒陈皮>炒陈皮>醋陈皮>蜜陈皮>陈皮生品>土炒陈皮>盐陈皮。其中，四制陈皮橙皮苷含量明显高于其他炮制品，且只有四制陈皮检测到橙皮素的含量。

2.8化学模式识别分析

2.8.1系统聚类分析 将各样品化学物质含量相对于称样量量化，导入SIMCA-P 14.1软件对样品进行系统聚类分析[16]。9个样品基本可分为3大类(图2)，S1聚为第1类，S2聚为第2类，S3～S9聚为第3类。

2.8.2样品主成分分析 分别将9个样品色谱峰信息输入Excel 表格内，得到样品个数×各峰面积数的数据矩阵，采用SIMCA-P 14.1软件进行PCA分析[17-18](图3)。结果显示9个样品大致可分3组，与系统聚类分析结果相一致。

2.8.3偏最小二乘法-判别分析 分别将9个样品峰面积信息输入Excel 表格内，得到样品个数×各峰面积数的数据矩阵，导入SIMCA-P 14.1软件中进行PLS-DA模型拟合，使用Ctr换算的数据标度方式进行标准化处理[19-20]。图4为生成差异性标记物的变量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)，其中VIP>1的成分6个，其影响大小依次为色谱峰P3(橙皮苷)、P21、P22、P20、P23(川陈皮素)、P15(橙皮素)，表明以上成分是不同陈皮炮制品之间成分差异的主要标记物，对陈皮质量差异有较大的影响。

3 讨 论

本研究采用多波长HPLC检测方法，利用二极管阵列检测器的时间波长程序的特点，使检测波长随时间变化而变化，可实现在各自最佳波长条件下多指标成分，多波长单行检测，获得与单一波长分析相似效果。该方法具有操作简便和稳定可靠的优势。

陈皮的成分复杂，其功效亦多样。2015年版《中国药典》一部主要以含量较高的橙皮苷作为陈皮的检测指标，不足以体现陈皮的多成分和多功效等特点。仅以测定单一成分作为质控，也难以较好地鉴定陈皮的内在质量。因此，建立以多成分指标的含量测定为主的陈皮质量检测方法体系，显得更为科学可靠[2]。本研究基于多波长HPLC检测以及化学模式识别技术分析，建立闽南漳州陈皮生品与炮制品的质量检测方法体系，明确样品间的归类属性，3种化学模式识别方法(HCA、PCA和PLS-DA分类模型)结果一致，均可鉴别陈皮生品与炮制品。本研究结果也表明陈皮生品与炮制品之间存在明显的差异，而且经 PLS-DA 筛选到陈皮6个主要差异性成分，鉴别其中3个成分(橙皮苷、橙皮素和川陈皮素)，为多角度控制该药材质量提供可靠数据。

黄酮类成分是陈皮的一大类活性成分，具有多样性药效，比如抗氧化、抗变态性反应、抗炎症、降血脂和保护心血管以及抗肿瘤等功效[21]。2015年版《中国药典》陈皮为陈皮生品，以橙皮苷含量作为评价陈皮质量的指标。本研究结果表明，陈皮经炮制后黄酮类成分有差异，四制陈皮、蒸陈皮、麸炒陈皮、炒陈皮、醋陈皮炮制后的黄酮类成分含量比生品陈皮的高。“饮片入药，生熟异用”是中医临床的用药特点，不同炮制方法对中药药性和药效产生着不同的影响。陈皮不同炮制品在中医的不同处方中发挥着不同的药效。本研究表明，闽南漳州四制陈皮橙皮苷含量明显高于生陈皮和其他陈皮炮制品，且检测出橙皮素成分；生陈皮和其余7种陈皮炮制品未检出橙皮素成分。橙皮素为一种二氢黄酮，是橙皮苷的苷元。橙皮苷为大分子化合物，其生物利用度较低，转化为苷元橙皮素后，可极大提升其生物利用度，更易于体内吸收。近年来研究还发现，橙皮素具有抗阿尔茨海默病、抗帕金森病、抗纤维化等作用[22]，这与闽南漳州四制陈皮取其降气、化痰、解郁之功一致。由此说明闽南漳州四制陈皮的炮制方法具有很好的品质特色，值得传承与推广。橙皮素的产生可能与炮制过程中经过高温与辅料共同作用所致，后续还将进一步深入研究。

本研究运用现代手段分析陈皮不同炮制方法中黄酮类成分存在的差异，阐述了闽南漳州四制陈皮在工艺和成分上的品质特色，为后续探讨炮制工艺和临床用药提供依据，同时对保护和传承闽南地区传统炮制技术具有深远的意义。