点按手法对CCI模型大鼠背根神经节PKC及P2X3表达的影响

陈乐春， 林志刚， 陈少清， 张幻真， 秦 丽， 陈水金， 王诗忠

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是一个复杂的病理生理过程，坐骨神经痛、腰椎间盘突出症等多种常见疾病均属于NP[1]。NP常反复发作，持续过程长，需长期治疗[2]。目前，针对NP的总体疗效欠佳，约50%的患者疼痛不能得到充分缓解。持续的疼痛感受导致患者的情绪、睡眠、工作和生活质量受到影响，也给社会医疗资源和患者的经济带来沉重负担[1,3]。中医推拿属于祖国传统医学，临床应用镇痛效果显著，在治疗神经根型颈椎病、腰椎间盘突出症、坐骨神经痛等疾病均有良好的临床疗效[4-6]，且副作用小[7]，具有独特优势。本研究拟通过疼痛行为学、蛋白免疫印迹、苏木精-伊红染色(H-E染色)等方法观察推拿常用的镇痛手法——点按对慢性压迫性神经损伤模型(chronic constriction injury, CCI)大鼠的镇痛作用，观察点按法干预对CCI模型大鼠DRG神经元PKC及P2X3表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物及分组 SPF级180～220 g雄性SD大鼠[上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号为SCXK(沪)2017-0005] 80只，统一饲养于福建中医药大学实验动物中心的SPF级实验室，模拟标准日夜系统，予以自由饮食及饮水。随机分为4组(每组20只)：空白组、模型组、假手术组、造模+点按组。

1.2主要药品及试剂β-actin抗体、P2X3抗体、兔抗PKC多克隆抗体、戊巴比妥钠(批号：B20150801，大连美仑生物技术有限公司)。

1.3主要仪器 恒温水浴锅、显微镜、蛋白核酸分析仪、无线触觉力按摩指套(日本Finger TPS公司)、自制推拿固定器。

1.2方法

1.2.1动物模型制备

1.2.1.1建模 采用Bennett和Xie模型制备方法建立大鼠CCI模型[8]，假手术组大鼠仅暴露坐骨神经后缝合，不打结，其余按模型制备手术操作。

1.2.1.2模型评估 CCI模型制备后大鼠出现跛行，足呈轻度外翻状，且有时出现舔舐、悬空等后肢保护现象，表明坐骨神经慢性挤压伤模型(CCI模型)制备成功。造模后常规肌内注射青霉素预防感染，若出现感染及其他疾患者弃去不用，对应补充，直到满足实验要求。

1.2.2触诱发痛的测定(von Frey 测试) 正式测试前大鼠静置笼中15 min适应环境。采用1～26 g不同等级的von Frey纤维丝由低等级向高等级逐一刺激大鼠双侧后肢足底心，加压至纤维丝弯曲持续5 s。每个纤维丝等级测试5次，其中有3次刺激出现大鼠缩足(记3个“+”号)则停止向上一等级测试，改向下一级重复测试，确定下一级不出现3个“+”号。机械痛足反射阈值为首个出现3个“+”的纤维丝等级。同一只大鼠两次测试需间隔至少30 s。

1.2.3干预措施 空白组不做任何处理，正常喂养；模型组、假手术组按上述手术操作；造模+点按组在造模后第4天介入点按手法，各组在相同环境及条件下正常喂养。

点按手法操作及取穴：先将大鼠固定，适应环境15 min。用手握空拳，拇指伸直并紧贴于食指中节的桡侧面，以拇指端为力点紧贴于大鼠术侧“委中穴”(后肢腘横纹中央)，用力要由轻到重(最大8 N)，稳而持续，至最大力时维持并停留3 s，后缓慢泻力，为1遍，重复10遍为1组。忌用暴力。为规范手法刺激量，采用拇指带上无线触觉力按摩指套进行手法操作，可实时显示作用力大小，控制力度最大为8 N，每天1组，连续干预18 d。

1.2.4蛋白免疫印迹(Western-blot)方法 干预完成后第2天，每组取10只大鼠断头处死，立即置于冰上，快速取出L4～L5背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)，置于离心管中，称体质量。经组织裂解，超声粉碎、匀浆、离心、取上清，依BCA蛋白定量法检测各组蛋白浓度。

蛋白电泳：按顺序安装好转膜装置，排出气泡，转膜，染色，漂洗，标记Marker位置，除染色，抗原抗体反应及显色(兔抗P2X3一抗，山羊抗兔二抗)，洗膜，膜片条带扫描及分析，图像采用Smart view分析软件得出条带密度值。

2 结 果

2.1大鼠触诱发痛指标结果 造模后，与空白组和假手术组比较，模型组和造模+点按组大鼠的触诱发痛在术后即开始下降(P<0.01)，表明存在痛觉过敏现象。点按手法干预后，与模型组比较，造模+点按组大鼠的触诱发痛在术后1～7 d无明显差别，至术后14 d开始上升，差别有统计学意义(P<0.05)，至21 d差别更为明显(P<0.01，表1，图1)。

表1 各组大鼠不同时间点触诱发痛von Frey测试结果

2.2大鼠DRG中PKC及P2X3的表达情况 与空白组和假手术组比较，模型组大鼠DRG中PKC及P2X3的表达水平差别有统计学意义(P<0.01)；推拿手法干预后，造模+点按组大鼠DRG中的PKC表达水平低于模型组[差别具有统计学意义(P<0.05)],高于空白组和假手术组[差别具有统计学意义(P<0.05)];P2X3受体的表达水平低于模型组(P<0.01)，高于空白组和假手术组，差别具有统计学意义(P<0.05，图2)。

3 讨 论

NP表现为慢性的自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛和感觉异常等临床特征[3,9]，从外周痛觉感受器到DRG再到脊髓上行至更高级的疼痛中枢，这个通路上任何一个环节出现问题都会导致疼痛信号传导异常。信号异常放大则引起疼痛过敏，相反则出现疼痛减退。

DRG细胞作为疼痛信号传递的中转站，在疼痛信息传递和整合过程中发挥着重要作用[10-11]。DRG细胞的离子通道功能改变，可导致初级伤害感受性神经元的敏感性和兴奋性增加，引起中枢敏化[12]。P2X3受体是一个对PKC调整敏感的表型开关，在DRG细胞中PKC信号传递途径可导致神经元表面的P2X3受体激活，受体的活性和表达上调可引发一系列反应，是外周和中枢痛敏形成的病理基础[10-12]。

本研究发现，造模组大鼠DRG中的PKC和P2X3的表达水平较空白组和假手术组增高，差别具有统计学意义(P<0.01)，提示坐骨神经CCI模型大鼠DRG细胞中存在PKC和P2X3过表达，证实PKC及P2X3与NP相关。通过推拿手法干预后，PKC表达水平(P<0.05)及P2X3受体的表达水平(P<0.01)均下降。笔者推测，推拿手法可能抑制DRG细胞中PKC表达及介导P2X3受体表达，抑制离子通道功能，降低DRG对于疼痛的敏感性和兴奋性，从而降低传递效能，使疼痛信号上行传递抑制或中断，发挥镇痛作用。

中医推拿在治疗慢性疼痛方面具有独特优势，而推拿手法在神经信号通路方面如何发挥作用值得研究。本研究通过点按法干预CCI模型大鼠，证实DRG神经元PKC-P2X3通路与NP相关。与假手术组及空白组比较，CCI模型大鼠的DRG细胞存在PKC和P2X3过表达，推拿手法干预可抑制CCI模型大鼠DRG中PKC及P2X3的表达，发挥镇痛作用。