蛋白源生物质的绿色生物转化

梁昕鑫 唐丹 霍毅欣，2

（1. 北京理工大学 生命学院 分子医学与生物诊疗工业和信息化部重点实验室，北京 100081；2. 苏州工业园区洛加大先进技术研究院，苏州 215123）

自全球工业化开始以来，人类主要以化石资源为原料生产燃料和大宗的精细化学品及药物中间体。但随着煤炭、石油、天然气等化石能源的枯竭及温室气体排放等环境问题的日益凸显，生物质开始跻身第四大能源物质，其作为原料主要用于新型植物源生物燃料及高级醇等清洁能源的生产，是一个非常有前景的新兴领域［1-3］。以往各种生物燃料或化工产品能否进入生产领域，主要取决于原有机体通过光合作用固定二氧化碳的效率及是否存在氮源的过度使用问题［4-6］。然而这些问题是相关联的，具体表现在：（1）在所有传统种植业中，固定二氧化碳所生产的糖或纤维素经发酵后都会产生大量的菌体蛋白质等副产物，如Pseudochlorellasp.，C.mexicana及C. pitschmannii利用碳水化合物发酵后，剩余蛋白达到总生物质含量的85%［7］。2015年，仅美国生物乙醇产业就产生了超过4×107t的干酒糟（DDGS）［8］。研究显示，如果使用木质纤维素等生物质为原料进行生物燃料生产，每年将在全球范围内产生超过2×1011t废弃物；一旦生物燃料在全球能源需求占比达到10%，每年将产生108t蛋白质废弃物［9］。目前这些蛋白质废弃物通常被用作动物饲料，2010年据Wijffels等［10］估计，如果利用微藻生物质为原料生产生物燃料，将产生超过3×108t的饲料原料等副产物，这大约是目前进口到欧洲的大豆蛋白数量的40倍，故目前已经趋于饱和的饲料市场可能无力容纳快速扩张的生物能源产业所带来的增量；（2）在所有现行方案中，菌体蛋白中所含的氮都无法被循环利用，新兴农业生物质的生产必须通过添加外源氮肥来补充氮素营养，而每年氮肥生产所耗费的能源约为人类一次能源供应的2.5%［11］；（3）蛋白饲料的应用导致了大量氮素通过动物粪便的形式流失到环境中，并被土壤微生物以氮氧化合物（NOx）的形式排放到空气中［12］。氮氧化物（如N2O）是温室气体，其对环境的危害作用高出同等质量的二氧化碳将近300倍，同时也是雾霾的重要组成成分［13］。如上所述，蛋白质作为自然界含量丰富的大分子有机物，其降解产物氨基酸中含有合成能源分子、化学品或者药物中间体所需的碳骨架以及微生物生长所需的氮元素。若对其分别加以利用，则能在保护环境的同时实现氮的循环和蛋白质这类副产物的资源化利用。

长期以来，自然界为了最大化养分的利用效率，生物更倾向于蛋白质的合成代谢而非分解代谢，所以存在蛋白水解产物脱氨这一技术瓶颈，导致蛋白质这一类丰富的资源物质难以得到大规模开发利用。直到2011年，合成生物学领域的研究者首次通过在大肠杆菌中工程化改造氮代谢通路（外源引入转氨和脱氨途径），为脱氨反应提供不可逆的代谢流，成功实现了蛋白质水解产物的脱氨，开创性地突破这一技术瓶颈［14］。在此研究基础上，该领域学者相继对蛋白源生物质的挖掘利用展开了一系列研究。例如，2013年，研究者以甘氨酸为底物在酵母中实现丁醇和异丁醇的生产［15］。2014年，学者拓展了利用蛋白废弃物进行生物转化的底盘宿主，用代谢工程改造后的枯草芽孢杆菌生产出产率达到18.9%的生物燃料和46.6%的氨［16］。至此，对蛋白质的开发利用并未止步。2017年，有研究利用蛋白废弃物的水解产物——氨基酸的脱氨反应，生产出高达458 mg/L的氨（产率为47.8%）［17］。2019年，Ma等［18］则开拓性地利用枯草芽孢杆菌将咖啡渣和豆渣废料（皆为蛋白质废弃物）转化成生物醇，进一步拓展了蛋白质原料的来源。不久前，又有研究考察了由氮响应转录机制驱动的基于蛋白质的生物精制过程，用补料分批发酵使得体系中异丁醇的产量最终达到4.78 g/L［18］。另外，有研究显示耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica）可利用生物燃料废弃物作为培养基生产单细胞蛋白和氨基酸［19］。以上研究都显示出，蛋白废弃物具备作为生产多种高附加值化合物原料的潜力和可行性（图1），是当下一直备受关注并快速发展的领域。有研究对蛋白废弃物资源化生产的各种高值产品进行估值，结果显示，其转化为散装化学品的收益最高。每吨生物质转化为散装化学品大概估值7 000.3元，转化为其他物质如运输燃料估值1 400-2 800元、动物饲料估值490-1 400元、电能估值420-1 050元［20］，故将种类繁多且数量巨大的蛋白质废弃物资源化利用具有重大的社会和经济意义（表1）。

1 基于氨循环利用的蛋白源生物质精炼方案

当前的生物燃料生产是以环境中生物固定CO2产生的生物质为原料，经生物转化为燃料来推动碳循环的流动，未能实现能源的最优化利用［8，22-24］。从生物燃料生产的全过程来看，最终产品仅集聚生物质生长过程中的一部分化学能，能量回收率最高仅达42.44%［7］。除了该过程中的能量损耗，其他生物物质如蛋白质、纤维素、木质素等生物质中含有的化学能并未得到全部转化，这也是导致目前生物燃料行业利润不佳的重要因素。此外，氮肥作为目前需求很大的化工产品之一（每年氮肥的化学合成达到1亿t），基于Haber-Bosch工艺生产1 kg氮肥需要57 MJ能源，其能耗问题也是一大负担［25-26］。以上问题都可以从以蛋白质为基础的生物精炼方案中找到解决思路。

在以蛋白质为基础的生物精炼方案中，蛋白质经水解产生的氨基酸通过转氨反应脱氨后得到碳骨架，继而可进一步转化为生物燃料、化学品或医药中间体等［22］。该过程中脱掉的氨被植物或藻类等生长过程摄取，用于其生物量的增长，实现了氮循环流动及对蛋白质这类副产物的资源化利用［22］。该技术的进一步发展将充分利用藻类经光合作用高效固碳的优点；同时，蛋白质废弃物的利用和氨的有效回收将有利于构建碳氮平衡的生物地球化学循环，实现资源的高效利用，具有生态友好性［25］。而且蛋白质在快速生长的光合微生物和工业发酵残留物中含量较高，因为污染的光合微生物实际上往往是生长较快的优势品种，相应地其蛋白质含量也较高，而蛋白正是我们可以利用的目标产物；另外，一般也可以靠藻种自身的特性来进行污染控制，如螺旋藻通过高pH值、杜氏盐藻通过较高盐度、小球藻通过快速生长控制污染，所以基本不用担心污染问题。因此，利用蛋白质作为原料可能会使菌体生长及CO2的固定速率最大化，整个循环体系的示意图见图2［27-30］。

图1 生物质精练主要过程及其下游产品（修改自文献［21］）

表1 各种富含蛋白质的生物质残留物中蛋白质的含量、价格和潜在价值

2 蛋白源生物质绿色高效生产高附加值化合物

蛋白质是多种氨基酸通过肽键缩合而成的聚合物，故其彻底水解产物为氨基酸，表2列出了多种富含蛋白质的生物质废弃物中各氨基酸的含量［21］。目前一些重要氨基酸已被生产并应用（表3）［21］。然而，由于微生物体内酶的化学动力学性质导致其体内的蛋白质更倾向于合成代谢，而非分解代谢［22］，所以蛋白质水解产物的脱氨反应实际上是受到了热力学可逆性和生物调节的双重限制，这使得科研工作者积极地对相关的生物转化途径及其上下游工艺进行代谢工程改造，以使微生物能够更加高效合理地利用蛋白源生物质，转化生成生物燃料、大宗化学品以及药物的中间体等。

图2 基于氨循环利用的微藻蛋白质转化生成异丁醇的示意图

表2 富含蛋白质的生物质废弃物经酸性条件水解后测定的氨基酸组成（湿重%）

表3 重要氨基酸的生产及其应用

2.1 在大肠杆菌中实现蛋白源生物质高效绿色转化

大肠杆菌自身具有用于高级醇生产的特殊代谢途径和关键酶，故其可作为生产高级醇的理想宿主［32-33］。基于Ehrlich途径，在大肠杆菌培养基中添加特定的酮酸可以表达相关的酶，从而催化相应醇的生成。Ehrlich途径的具体流程如下：氨基酸脱氨生成α-酮酸，酮酸脱羧生成醛，醛被还原生成醇。故氨基酸脱氨是通过Ehrlich途径产高级醇的第一步，但在自然界中，为了最大化养分的利用效率，微生物倾向于以氨基酸为单元再次合成蛋白质。为使工程菌株能够将单一氨基酸或者蛋白质（代谢的混合物）定向转化为某一种或几种高附加值的生物产品，Huo等［14］在大肠杆菌中进行了相关研究（图3），具体如下：（1）构建突变库，确定氨基酸降解的相关调控蛋白并使之失活；（2）对分解反应关键酶进行定向进化以获得具有更高反应速度及底物亲和性的突变体，并将其整合入工程菌；（3）通过构建氨泵使蛋白质降解所脱掉的氨排出胞外；（4）构建了高效的代谢通路将蛋白质降解所产生的碳骨架转化为高附加值产品；（5）通过构建人工氨基转移循环并将氨基酸的脱氨反应与不可逆反应偶联，从而实现对所有氨基酸的不可逆脱氨。最终，实现了微生物发酵生产中氮元素的循环利用，结果显示，在一个有酮酸途径存在的菌株中，改造转氨酶使其不可逆地释放氨，阻断群体感应系统，使得工程菌株中蛋白质水解产物脱氨生产生物燃料的产量达到理论产率的56%［14］。另外，大肠杆菌也可以将苏氨酸脱氨生成2-氧代丁酸［34］，将苯丙氨酸转化生成肉桂酸［35］，将天冬氨酸的α-脱氨基以生产富马酸/马来酸［36］等重要化工产品。由上述研究结果可知，氨同化途径失效和转氨循环的改进是阻止氨再摄取和驱动脱氨的重要步骤［31，37］，也是实现蛋白源生物质高效绿色转化生成高附加值化合物的关键技术。

图3 大肠杆菌中以氮为中心的代谢工程策略

如果综合利用代谢动力学和生物调节的信息，一些氨基酸可以直接脱氨基生成α-酮酸，然后可以通过具有广泛底物特异性的α-酮酸脱羧酶转化为醛等化合物，再通过醇脱氢酶转化为醇类；其他氨基酸可以脱氨基成为三羧酸循环的中间体（图4），其可以通过糖异生途径中的酶如苹果酸酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶导向生成丙酮酸（一种主要的代谢中间体）。然后丙酮酸通过多种代谢途径转化成各种高级醇及化学品（图5）。Choi等［38］利用代谢工程策略对大肠杆菌进行改造，通过过表达ilvA（编码抗反馈的苏氨酸脱水酶）以及删除逆代谢途径上的基因（ilvI、ilvH、ilvB和ilvN），然后过表达cimA（柠檬酸合酶）和adhEmut（醇/醛脱氢酶突变体）将碳通量导向2-酮丁酸，2-酮丁酸再转化为丙酸，之后生成1-丙醇，最终产量高于10 g/L。与之类似，Wang等［39］通过重新构建并优化D-1，2，4-丁三醇（BT）的生物合成途径，使大肠杆菌利用高纯度的D-木糖或玉米棒水解产物生成BT 的含量达到5.1 g/L BT。

图4 与中心代谢相关的蛋白源氨基酸的分解代谢途径（修改自文献［40］）

2.2 其他底盘宿主利用蛋白源生物质高效绿色生产

斯氏梭菌（Clostridium sticklandii）和其他梭状杆菌属胞内含有可降解氨基酸的代表性途径（Stickland反应）和相关酶（辅酶B12依赖性氨基变位酶，含硒氧化还原酶和对氧极其敏感的2-羟脂酰-CoA脱水酶），可以用来生产生物燃料［41-43］。在该类菌属中，C. sticklandiiDSM 519有成为绿色生物燃料高效生产的微生物细胞工厂的潜力，其能够通过Stickland反应分解氨基酸生成丙酮酸（一种主要的代谢中间体），从而进一步发酵成乙醇/正丁醇及乙酸/正丁酸［44］。酵母则是工业上应用最为广泛的发酵微生物之一，可以通过氮代谢阻遏效应（NCR）的调节机制选择性地利用底物［45］。例如，酵母以甘氨酸为底物经脱氨基等一系列反应后，系统中异丁醇和正丁醇的产量分别达到了58和92 mg/L［15］。胶红类酵母菌（Rhodotorula glutinis）用L-苯丙氨酸为唯一碳源和氮源，发酵生产反式肉桂酸［46］。此外，缬氨酸在链霉菌中可转化合成大环内酯类抗生素［47］，而在铜绿假单胞菌中可氧化脱氨生成2-氧代异戊酸［48］。Izaguirre等［49］将城市固体垃圾堆肥酶促水解后，从其有机部分中回收了多种游离氨基酸，回收率达76%，将其用作乳酸菌生长及生产乳酸的氮源，在发酵工业乳杆菌（Lactobacillus fermentumATCC 9338）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarumNCIMB 8826）中达到的最大乳酸浓度分别为9.0±0.2 g/L和11.1±0.1 g/L。以上研究都对蛋白质的生物转化利用提供了可行的思路。

图5 以葡萄糖为基础的生物质衍生的工业化产品生产流程及合成途径（修改自文献［40］）

3 蛋白源生物质的持续可获得性

在以蛋白质为前体的生物精炼过程中，蛋白质的来源可以从短期和长期两方面分析。短期而言，利用碳水化合物和脂类生产生物乙醇和生物柴油过程中会产生大量蛋白质废弃物；长期来看，藻类以二氧化碳为唯一碳源进行生长，且蛋白质含量相对较高（表4），因此可以大规模种植微藻来生产蛋白质，作为蛋白质生物精炼的前体［10，50］。此外，由于光照几率高、比表面积大和光合作用效能高，故微藻通过光合作用固定CO2的效率（6%-10%）较陆生植物（1%-2%）更高［51］。微生物利用藻类经光合作用产生的蛋白质来生产能源物质，可有效降低目标产物的生产成本，促进生产效率的提高和生产过程的可持续性［14，31，50，52］。另外，近年来，随着合成生物学和代谢工程改造手段的发展，嗜盐微生物的全基因组序列和分析信息日渐丰富，对其改造更具有靶向性，将有可能实现利用海水等非饮用水进行多种高级醇的生产，可以降低生产成本，提高产品的竞争性。

表4 藻类各组分及含量比例（干重百分比）

4 蛋白源生物质绿色转化中技术优化面对的挑战与策略

上述基于氨循环利用的方案将为实现氨基酸的生物转化提供更多的理论基础，也对现有优化技术提出挑战。结合多项组学的数据集分析可以对微生物细胞的潜在特征进行检测，有助于对其功能背后机制的解读。在工程设计微生物过程中，引入DNA溯源技术和高通量筛选，是蛋白质高效绿色转化的有效策略［53］。Li等［54］研究了在白酒发酵中特异性地将氨基酸转化为高级醇所涉及到的基因和酶，其中LEU1编码α-异丙基苹果酸脱氢酶，LEU2编码β-异丙基苹果酸脱氢酶和ILV1编码苏氨酸脱氨酶。ILV1双等位基因缺失的二倍体突变体分别使异丁醇、异戊醇和正丙醇的产量增加326.4%，57.6%和14.09%。此外，通过使用碳通量和氮通量修饰等工程化策略，还可以提高其他多种化合物的产量［33，37，55-59］（图6）。

图6 提升高级醇的产量的工程化策略

以微藻生物质为例，对微生物进行连续发酵和酯交换生产燃料的整个过程中的碳氮通量进行计算。微藻蛋白质在转化过程中，会生成副产物——氨。基于计算结果，构建了重新施用氨的工艺流程，如图7所示。如果种植富含蛋白质微藻的开放池塘的尺寸为24 600 km，在生物质生长之后，对收集的原料蛋白质进行水解，每年可产生1.360亿t高级醇（600亿gal的生物燃料）［60］。基于前述的微藻和代谢工程细菌结合的生物燃料生产方案［14］，每年的微藻蛋白可产生97.5万t生物燃料和5 480万t氨［27］。

通过使用高效节能的预处理，可以解决生物质因其各种生理特性（包括细胞壁厚度和生物成分含量）导致的利用受限问题。对微藻生物质进行适当预处理，可以获得良好的能量转化和生物燃料产量。Ha等［7］使用绿藻假单胞菌（Pseudochlorellasp.）对微藻生物质进行连续发酵和酯交换处理，获得0.45 g生物乙醇/g碳水化合物、0.44 g高级醇/g蛋白质和0.55 g生物柴油/g脂质，碳水化合物和蛋白质的发酵效率为86%和72%，总能量回收率为42.44%［43］。

5 展望

图7 重新施用氨的工艺流程图

生物燃料的高效生产对我国增加能源供应、推进环境保护意义重大。通过底物生产过程中氨的循环利用，可以从源头解除过量氮排放对空气和饮用水安全造成的威胁。生物将大气中的N2固定后转化为NH3或者铵盐，通过同化作用进一步合成氨基酸和其他含氮化合物，或者通过硝化细菌的硝化作用生成亚硝酸盐及硝酸盐；在厌氧条件下，硝酸盐又能经反硝化作用分解成为N2进入大气，实现氨的自然循环。然而，现代社会发展中，人类大量使用化石能源，直接将空气中大量的N2直接转化为氮肥，工业固氮水平（＞100 Tg/a，Tg，1 012 g）与地球上的自然固氮水平基本（130-450 Tg/a）相近，这极大破坏了氮素的自然循环体系［27］。此外，人类活动使得未经处理的富含N、P的生活废水大量排进水体，造成全球水体富营养化，藻类大量繁殖，致使水华大范围爆发，人类的饮用水安全面临前所未有的严重威胁［61］。因此，实现NH3在能源物质工业化生产中的循环利用，能够改善大气的富氨状态，缓解水体富营养化，进而从根本上解除主要空气污染以及蓝藻水华对饮用水安全造成的威胁。

目前对生物燃料生产菌株的改造策略主要集中于碳代谢流，经改造的酵母和细菌菌株已经成功用于乙醇的生产。但以氮为中心进行的代谢工程改造，其利用蛋白质为原料进行生物精细化的可行性也得到了相关研究的支持［14，62］。然而大批量蛋白质的获得仍然是一个待解决的问题，在此，微藻可作为大规模生产蛋白质的重要来源，因其具有以下特点：第一，藻类生产的蛋白质是其固碳相关酶的来源。油脂是微藻储能物质，其含量的积累和生物量的增加呈负相关，而生物量和蛋白质的增加无须脂类积累过程中必要的饥饿条件。因此，蛋白质含量丰富的藻种可以在快速固定CO2的状态下实现生物量的高效积累，使得用于微生物能源生产的底物（蛋白质）的产率和总量得到增加。第二，蛋白质含量丰富的微藻的快速生长有利于开放式培养系统的应用。与蛋白质含量较低的微藻以及其他陆生作物相比，快速生长的微藻具有生长优势，可以最大化二氧化碳的固定效率［10，29，50，63］。此外，废弃物处理和发酵工业中的蛋白质生物质也作为长期、可持续的蛋白质来源，避开昂贵的光生物反应器的需求或木质纤维素的顽固性问题［64-66］。回收的氨可用于未来的蛋白质生产、传统农业栽培或其他化学品的生产。蛋白质转化为生物能源过程中生成的氨，也使资源分配在一定程度上摆脱生长繁殖及生存维持的限制，利于构建高效的细胞工厂［22］。然而，目前仍有一些挑战有待突破，包括藻类大规模生产、收获、产品净化和硝基回收等过程中存在的问题（表5）。此外，随着代谢网络智能改造、异源重组表达和实验室进化技术进入实际应用，也给微生物工厂带来新的挑战［67］。采用基因编辑技术、代谢途径组装技术及发酵过程优化技术等方法对微生物细胞内氮代谢的层级网络进行改造（图8），为进一步阐明氨代谢的调控机理提供参考。可以想象，利用蛋白质作为生物精细化原料的潜在优势可能会刺激这一方向的发展。

图8 氮同化过程

表5 微藻生物能源工业化生产概况一览表

能源危机以及环境问题一直是社会各界关注的重点，基于氮平衡的二氧化碳微生物转化给出了有效的解决方案，但微生物细胞工厂利用氨基酸发酵生产高值化学品的生物转化的经济可行性取决于大规模生产力和生物转化技术。高能量密度的生物燃料可提高发动机效率，因此获得最佳性能只需要更少的燃料［22］。对遗传改良、生物精炼以及从各种生物质中大规模生产高级醇的进一步研究，将促使这一进程尽早落地，实现商业化［68］。基于模式生物大肠杆菌进行的改造仍是未来的研究方向，利用大肠杆菌自身修复系统和抗逆机制，通过合成生物学技术对菌株和途径进行改造，从而得到抗逆性强的大肠杆菌菌株，以应用于高值产物的生产。另外，合理的代谢设计和实验室进化两者之间的协同作用，也有助于优化代谢网络，推动可持续性能源的发展。