二代测序在膝关节置换术后迟发性感染关节液中病原菌检测中的应用价值

赵玲 李浩然 郭巍 张韶辉 崔青

关节置换手术后人工关节发生感染是临床常见并发症，常见感染类型包括急性、迟发性、慢性[1]，其中迟发性感染发病缓慢，发病后病情多呈恶化趋势。传统微生物培养鉴定时间较长，若遇厌氧菌及难鉴定细菌，鉴定时间常延至7天甚至更久，并且可能存在假阴性结果。二代测序技术是随着分子生物学发展、基于PCR而形成的一种病原菌诊断方法，敏感性高，检测速度快[2]。近年来，二代测序逐渐用于感染性病原菌的识别与鉴定，在血液样本微生物检测中有较高应用价值[3]。本研究利用二代测序技术与传统微生物培养共同测定膝关节置换术后迟发性感染病人关节液中的病原菌类型，探讨二代测序在膝关节置换术后感染中的应用价值。

对象与方法

一、对象

选取2014年2月～2019年3月我院收治的膝关节置换术后合并感染病人41例，其中初次关节置换后感染7例，翻修术后感染34例。年龄37～71岁，平均年龄(58.47±3.51)岁，男20例，女21例。骨性关节炎26例，类风湿性关节炎15例，骨水泥假体置换22例，非骨水泥假体置换19例。纳入标准：(1)符合肌肉与骨骼感染协会(muscularskeletal infection society，MSIS)的人工关节假体感染标准[4]；(2)初次膝关节置换手术后及翻修术后感染；(3)人工关节处有疼痛、红肿、局部发热症状；(4)发生感染时间均在术后5个月～2年内；(5)入院后停用抗生素2周再取样进行微生物培养。排除标准：膝关节置换手术前合并全身性感染或为开放性骨折；关节液量不足以用于二代测序及实验室微生物培养；合并恶性肿瘤；合并全身免疫系统疾病及长期使用免疫抑制剂类药物。本研究获医学伦理委员会批准，所有病人及家属对本研究内容充分知晓，自愿签署知情同意。

二、方法

1.检测方法：对所有病人取样，收集关节液。在膝关节的髌骨上方经股四头肌腱外侧向内穿刺进关节囊，抽取3 ml关节液，分2部分注入2支无菌管中，一部分保存至-80℃冰箱中，一部分送至我院微生物实验室。所有标本均在抽取后30分钟内接种完成。培养基选择血平板、巧克力平板、需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶。血培养瓶放置美国BD公司BACTECTM FX40全自动血培养系统中。培养出的细菌均采用梅里埃VITEK 2 Compact微生物自动鉴定系统进行鉴定。

对保存于-80℃冰箱的关节液进行细菌DNA提取。方法：解冻后使用加样枪取200 μl标本转入新的无菌管中，采用DNeasy Blood& Tissue kit试剂盒进行DNA提取，操作步骤参考试剂盒说明书。取略大于500 ng提取完成的模板DNA，进行二代测序：首先进行细菌16S rDNA基因的PCR扩增，PCR反应条件为95℃ 2分钟预变性，95℃ 5秒变性、60℃ 30秒退火、60℃ 30秒延伸，循环45次。再将扩增得到的DNA分析进行DNA文库制备、emPCR平行扩增、测序。测序所得结果中去除长度<50 bp的低质量、低复杂度序列，得到高质量的序列，同时消除人源基因组干扰。结果判读：由计算机将测序得到的序列对比数据库中细菌序列，识别鉴定出各种细菌。采用USEARCH软件中UPARSE算法对二代测序中每个样本中检出的细菌序列多样性及丰度进行分析：(1)对有效序列进行聚类，将有97%序列相似度的序列归为一个操作分类单位(operational taxonomic unit，OTU)；(2)使用USEARCH软件及相应数据库，将每个OUT代表序列与数据库进行对比，计数每个样本注释到不同细菌分类水平上的序列数；(3)使用QIIME软件计算样本α多样性，包括Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数，Chao1与ACE指数主要体现样本物种丰度信息，Simpson与Shannon主要体现物种多样性信息，ACE及Chao1指数越大表示物种丰富度越高，Shannon指数越大表示物种多样性越高，Simpson指数越趋近于0表示物种多样性越高。

2.观察指标：两种方法对41例病人关节液中细菌检出情况；41例病人由二代测序测得的样本α多样性。

三、统计学分析

应用SPSS 23.0软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.膝关节置换术后合并感染病人典型病例：女，63岁。双膝关节骨关节炎，右侧膝关节置换术后6个月发生感染。见图1。

2.41例病人二代测序与细菌培养的细菌检出率比较：在种水平上分析两种方法最终检出的细菌情况，细菌培养未检出停乳链球菌，两种方法均未检出真菌。细菌培养结果中，有29例(70.73%，29/41)病人同时感染了2种细菌，1例病人检出3种细菌(优势菌2种，另一种推测是由于样本污染导致)；二代测序检出同时感染2种细菌的病人为34例(82.93%，34/41)，且其中囊括细菌培养检出的29例病人，另有1例病人检出6种细菌。二代测序检出的感染金黄色葡萄球菌病人13例(70.73%，13/41)明显多于细菌培养5例(12.20%，5/41)(P<0.05)。见表1。

A.初次全膝关节置换术前双膝关节正位X线片示双侧膝关节间隙狭窄、骨质增生、硬化；B.全膝关节置换术后双膝关节正位x线片示假体位置良好；C.右侧膝关节置换术后6个月发生感染正位x线片，右胫骨平台下骨质溶解，胫骨侧假体松动。

表1 41例患者二代测序与细菌培养的细菌检出情况(例，%)

3.41例病人由二代测序测得的样本α多样性：二代测序得到41例病人样本中细菌ACE指数平均为(12 834.06±317.52)，Chao1指数平均为(8 025.37±351.08)，Simpson指数(0.53±0.01)(图2)、Shannon指数(5.06±0.11)(图3)。

图2 Simpson指数

讨论

双脱氧法测序是利用某种DNA聚合酶延伸结合待定序列模板上的引物，一直结合到某种终止核苷酸为止[5]。21世纪分子生物学新型微生物鉴定方法已发展到第二代测序法，即高通量测序[6]。二代测序在一次测序后就能获得所有病原菌的DNA序列，成本低，合成、延伸、测序步骤可同时进行，缩短测序时间[7]。目前，应用较广的二代测序技术包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Single Molecule Sequencer等[8]，在癌症分型、病毒鉴定领域逐步发挥优势[9-10]。二代测序还可以通过与抗生素耐药基因数据库和毒力因子数据库进行对比，分析细菌的耐药基因及细菌毒力[11]。二代测序成本相对较低，但目前测序设备的费用仍较高，临床有二代测序需求时，常委托第三方实验室进行测序。

本研究中纳入的迟发性感染病人是指在术后数月、数年后才出现感染症状的病人，此类病人一旦发病，病情进展迅速[12]。迟发性感染多因术中创口污染或术后创口愈合不良，浅层创口逐渐侵入深部，在关节深部定植并累及其他部位。传统实验室细菌培养在区分多种类型的细菌时不具有优势，这是因为一个培养基营养有限，若一个病人的某种样本中存在多种细菌，会发生争夺营养情况，这不利于了解病人病原菌详细分布类型。另外，多种细菌在同一培养基上生长时可能出现菌落混合生长的情况，此时需要进行仔细分离纯化，若遇细菌污染情况，分离纯化结果不良，则需进行二次取样培养，大大延长细菌培养鉴定时间。如本院中对于血培养仪中细菌的检测，需氧菌需3～5天才能得到结果，厌氧菌则需7天才能出结果。因此，通过二代测序方式对膝关节置换术后迟发性感染的病人进行详细、全面的病原菌鉴定非常有必要。

本研究发现二代测序检出的细菌种类囊括了传统细菌培养检出的细菌种类，表明二代测序法在关节液细菌的鉴定中有重要临床意义。传统细菌培养未检出任何感染了停乳链球菌的病人，而二代测序检出5例感染了停乳链球菌的病人。这表示二代测序可检测并鉴定出传统细菌培养无法鉴定出的细菌类型。同时，二代测序鉴定出感染金黄色葡萄球菌的病人占70.73%，高于传统细菌培养的12.20%。二代测序鉴定出感染表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌的病人比例虽然与细菌培养比较差异不明显，但仍可以看出二代测序检出的感染以上细菌病人比例高。表明二代测序在鉴定以上细菌时较细菌培养更敏感。两种方法鉴定出感染大肠埃希菌的病人比例相同，且经对比发现是相同6例病人。表明对于大肠埃希菌，二代测序与细菌培养鉴定结果具有一定一致性，不会产生较大偏倚。其原因可能是由于大肠埃希菌是常见的革兰阴性致病菌，其生长环境对营养要求不苛刻、菌落易识别，常规实验室培养基上即可直接检出。两种方法均未检出真菌，表示在本研究中41例病人不存在真菌感染，也提示膝关节置换术后迟发性感染病人中真菌感染率低。本研究传统细菌培养最多在1例病人关节液样本中检出3种细菌，但从该病人的微生物平板内细菌分布情况来看，其中有1种细菌可能是由于样本污染造成的，因此检出的致病菌仍为2种，而二代测序结果显示最多在1例病人的关节液样本中检出6种细菌，其中占优势的致病菌有3种。由此可见，传统细菌培养的精准性确实低于二代测序，且依赖人工的经验。从二代测序后的细菌群落丰富度及多样性分析，本研究中Simpson指数约为0.05，Shannon指数处于中等水平。虽然Simpson指数不明显趋近0，但ACE及Chao1指数体现出较高水平，表明在41例病人关节中，采用二代测序可检出较高物种丰度，对微生物多样性检出的水平还有待研究。

总体而言，在本研究纳入的膝关节置换术后感染的病人中，均可检出致病菌，二代测序能检出高物种丰度，在微生物多样性方面，二代测序检出的细菌多样性也较多，既可囊括传统细菌培养检出的细菌种类，又可检出细菌培养无法检出的细菌种类。朱逸敏等[13]研究表明，二代测序已成为病原学诊断的有效方式，与传统细菌培养方式比较具有快速、定量分析的优点，但二代测序发展到现阶段仍缺乏明确的公认的判读标准，后续仍需通过增大样本量，通过与传统细菌培养相比，进一步验证二代测序的优势。