CaSR在宫颈癌C-33A细胞增殖和迁移中的作用研究*

袁辉 张淑敏 王得利 栾海蓉 石屹 徐吉雨

钙敏感受体（calcium sensing receptor，CaSR）是G 蛋白偶联受体超家族中C 家族成员，由1 078个氨基酸组成，包含四个主要区域：细胞外N 末端区域（ECD）、连接ECD 和第一跨膜的富含半胱氨酸结构域螺旋结构、七个跨膜（TM）结构域和细胞内结构域[1-3]。广泛表达于真核和原核细胞，其配体为多价阳离子和多胺等。具有维持机体钙稳态及其他金属离子稳态的功能[4-6]。本研究拟通过观察CaSR 在裸鼠移植瘤模型和C-33A 细胞中的表达情况，通过给予CaSR 激动剂（R568）、CaSR 抑制剂（Calhex231）干预，从而推断CaSR 调控宫颈癌C-33A 细胞增殖和迁移的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞及分组 30 只5 周龄BALB/c雌性裸鼠（18±2）g 购自常州卡文斯实验动物有限公司。造模采取裸右侧腋下皮下注射C-33A 细胞悬混液（5.5×107个/mL）。按瘤体大小均匀分组：Model（移植瘤模型）组、Model+R568 组和Model+Calhex231 组，每组10 只，体重分别为（22.18±2.03）、（23.99±2.45）、（22.79±2.77）g，三组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。Model+R568组和Model+Calhex231 组每日分别腹腔注射R568（10 μmoL/kg）和Calhex231（10 μmoL/kg）。SPF 级饲养1 个月，安乐死后主动脉取血并分离取出移植瘤称重。体积（mm3）=0.5×长径×短径2。抑瘤率=（Model 瘤重-Model+R568 组或Model+Calhex231 组瘤重）/Model 瘤重×100%。宫颈癌C-33A 细胞购自上海泽叶生物科技有限公司（货号：AC102117）分为Control 组，R568（5 μmoL） 组，Calhex231（3 μmoL）组。

1.2 ELISA 法测定血清及培养基中MMP2 和MMP9含量 ELISA 测定试剂盒均购自Beyotime 公司，饲养4 周，取待测鼠血清（培养基）后，置于冰盒内。在96 孔酶标板中，设置标准蛋白孔、空白孔、对照孔和待测孔。按照厂家提供说明操作，显色后使用酶标仪，在450 nm 波长条件下检测每个待测孔的OD 值，最后按照标准曲线和公式计算每组待测血清（培养基）中MMP2 和MMP9 浓度。

1.3 Western blot 检测蛋白表达 将研磨碎的瘤组织（C-33A 细胞）置于1.5 mL EP 管中加入0.5 mL RIPA缓冲液裂解，然后在4 ℃条件下离心（13 500 r/min，25 min），收集上清液并在-80 ℃下保存。使用BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime，产品编号：P0023）检测每个样品的蛋白质浓度。应用12.5%的SDSPAGE 电泳分离各组蛋白，而后将待测蛋白转移到PVDF 膜上。在室温下，用5%脱脂奶粉封闭2 h，用以下一抗（1︰1 000 稀释，4 ℃）将膜孵育过夜：CaSR、Bax、Bcl-2、E-cadherin、β-catenin 和VEGFR3（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，Texas，USA）。用抗鼠/兔IgG 抗体（1︰5 000 稀释，北京蓝博斯特生物有限公司，产品编号：LBI01）室温孵育1 h。采用ECL 法在化学发光仪上显色，应用Image J（v1.8 版本）图像处理软件测量条带灰度值，计算各组的蛋白相对表达量。

1.4 CCK8 检测C-33A 细胞增殖和细胞划痕实验 （1）按照实验步骤分组后，将C-33A 细胞接种于96 孔板（5×103/孔），设立空白对照组，观察细胞状态良好即可加药处理，随后继续培养48 h（37 ℃，5%CO2）；取出96 孔板，用预冷PBS 洗涤3 次，把液体甩干后向每孔加入10 μL CCK-8溶液，封板后在37 ℃温箱中孵育60 min，使用酶标仪在450 nm 波长范围检测每个待测孔的OD 值。（2）C-33A 细胞接种于6 孔板中（1×106），无菌条件下，在6 孔板背后画6 条横线，每条线间隔0.5 cm。弃掉培养基，PBS 清洗后用枪头与所画横线成90°角划过，随后PBS 洗涤细胞3 次，分别加入加药处理的培养基，在37 ℃，5%CO2培养箱中培养，在0 h 和24 h 取出6 孔板应用光学显微镜拍照。

1.5 Fluo 4-AM 荧光探针检测细胞内钙变化 将C-33A 细胞接种于24 孔板中（2.5×105/孔），分别加入加药处理的培养基，24 h 后，用灭菌预冷的PBS 清洗3 次。在37 ℃避光条件下，加入HEPES溶液配置的Fluo 4-AM 工作液300 μL。30 min 后，每组选取8～10 个细胞为观察对象，用荧光显微镜（Olympus Ⅸ-70）检测细胞内钙变化，激发波长480～500 nm，发射波长525～530 nm。

1.6 qRT-PCR 检测Bax 和Bcl-2 基因表达 按照厂家提供的操作步骤，使用Trizol（Invitrogen，15596026）从各组C-33A 细胞中提取总RNA。用逆转录试剂盒（TaqMan）以2 μg 的总RNA 合成cDNA。使用SYBR Green PCR 试剂盒（Applied Biosystems，USA）在Light Cycler®480 序列检测系统（Roche Life Science，Germany） 上检测Bax 和Bcl-2 的mRNA 表达水平。以β-actin 为内参，根据待测基因和β-actin 循环数CT 值，按照公式相对值=2-△△CT计算相关表达。Bcl-2 上游引物：5′-CTTCCGTGATGGGGTCAACT-3′，下游引物：5′-AGGTACTCGGTCATCCAGG T-3′；Bax 上游引物：5′-ATGGACGGGTCCGGGGAGCA-3′，下游引物：5′-CCCAGTTGAAGTTGCCGTCA-3′，β-actin上游引物：5′-CCGGCTTCGCGGGCGACG-3′，下游引物：5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCC-3′。

1.7 统计学处理 应用SPSS 18.0 软件对实验数据进行统计分析，计量资料用（）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组移植瘤瘤重及体积的比较 30 d 后取各组裸鼠瘤组织称重，Model 组移植瘤瘤重 为（345.14±22.33）mg，Model+R568 组为（231.43±21.24）mg，Model+Calhex231 组 为（415.37±30.01）mg，Model+R568 组的移植瘤瘤重低于Model 组，Model+Calhex231 组的移植瘤瘤重高于Model 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Model+R568 组的抑瘤率为（33.1±3.6）%。在饲养5、10、15、20、25、30 d，测量移植瘤体积，与Model 组比较，Model+R568 组显著抑制肿瘤生长而Model+Calhex231 肿瘤体积显著增加（P＜0.05），见表1、图1。

表1 三组移植瘤体积的变化情况比较[mm3，（）]

表1 三组移植瘤体积的变化情况比较[mm3，（）]

图1 三组移植瘤体积的变化情况比较

2.2 三组裸鼠血清中MMP2 和MMP9 含量比较 Model+R568 组的MMP2 和MMP9 水平均低于Model 组，Model+Calhex231 组的MMP2 和MMP9 水平均高于Model 组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组裸鼠血清中MMP2和MMP9含量比较[ng/mL，（）]

表2 三组裸鼠血清中MMP2和MMP9含量比较[ng/mL，（）]

*与Model 组比较，P＜0.05。

2.3 三组移植瘤组织中CaSR、E-cadherin 和Bcl-2的表达情况比较 Western blot 测定结果显示，分别以CaSR、E-cadherin 和Bcl-2 与β-actin 的比值为参数，与Model 组比较，Model+R568 组的CaSR 和E-cadherin 蛋白表达均显著增加而Bcl-2 的表达量显著减少，Model+Calhex231 组CaSR 和E-cadherin蛋白表达均显著降低而Bcl-2 的表达量显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3、图2。

2.4 C-33A 细胞在各组增殖和迁移情况比较 将Control 组指标标准化为1 后，与Control 组比较，R568 组细胞活力（0.55±0.04）和迁移速率（0.60±0.17）均显著降低，而Calhex231 组细胞活力（1.38±0.17）和迁移速率（1.42±0.23）均显著增加（P＜0.05）。C-33A 细胞迁移统计见图3。

表3 三组移植瘤组织中CaSR、E-cadherin和Bcl-2的表达情况比较（-x±s）

图2 三组移植瘤组织中CaSR、E-cadherin和Bcl-2的表达情况比较

图3 C-33A细胞在三组中的迁移情况比较

2.5 三 组CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2 和VEGFR3 在C-33A 细胞中的蛋白表达情况比较 分别以CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2 和VEGFR3 与β-actin 的比值为参数，与Control 组比较，R568 组CaSR、Bax、E-cadherin 和β-catenin 蛋白表达均显著增加而Calhex231 组上述蛋白表达均显著减少，Bcl-2 和VEGFR3 表达趋势与上述结果相反，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图4、表4。

图4 三组CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2和VEGFR3在C-33A细胞中的蛋白表达情况比较

2.6 三组C-33A 细胞内Ca2+浓度及细胞培养基中MMP2 和MMP9 含量变化情况比较 荧光强度检测结果显示，与Control 组比较，R568 组Ca2+浓度显著增加而Calhex231 组Ca2+浓度显著下降，见表5、图5。ELISA 检测培养基中，与Control 组比较，R568 组MMP2 和MMP9 含量均显著降低而Calhex231 组均显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表6。

表4 三组CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2和VEGFR3在C-33A细胞中的蛋白表达情况比较（）

表4 三组CaSR、Bax、E-cadherin、β-catenin、Bcl-2和VEGFR3在C-33A细胞中的蛋白表达情况比较（）

*与Control 组比较，P＜0.05。

表5 三组C-33A细胞内不同时间点Ca2+浓度比较（）

表5 三组C-33A细胞内不同时间点Ca2+浓度比较（）

表5（续）

图5 三组C-33A细胞内Ca2+浓度比较

表6 三组C-33A细胞培养基中MMP2和MMP9含量比较[ng/mL，（）]

表6 三组C-33A细胞培养基中MMP2和MMP9含量比较[ng/mL，（）]

*与Control 组比较，P＜0.05。

2.7 三组C-33A 细胞中Bcl-2 和Bax 基因表达情况比较 qRT-PCR 检测显示，与Control 组比较，R568 组Bax 基因表达显著增加而Calhex231 组表达显著减少，Bcl-2 基因表达量与上述结果相反（P＜0.05），见表7。

3 讨论

癌症是当今医学最为关注的疾病之一。根据WHO 官方数据统计，2018 年全球新增1 810 万癌症病例，死亡人数达960 万，其中男、女患病比率接近1︰1，死亡比率1︰0.89。可见，女性和男性同样遭受着肿瘤的侵害和困扰[7-9]。宫颈癌是女性最为常见的肿瘤之一，其死亡率在我国一直居高不下。当今医疗策略为早期发现早期治疗效果最好，5 年生存率约65%以上，而晚期和复发性宫颈癌治疗效果极差[10]。宫颈癌目前主要治疗手段仍为化疗和手术治疗，但副作用和手术创伤严重，可见，明确其发病机制和研发有效靶点药物才是关键所在[11]。CaSR 是G 蛋白偶联受体超家族中C 家族成员，在细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老和肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[12]。现有文献[12-14]已证实，CaSR 参与心肌缺血再灌注损伤、糖尿病心肌病、心肌梗死和消化道肿瘤等。

表7 三组C-33A细胞中Bcl-2和Bax基因表达情况比较（）

表7 三组C-33A细胞中Bcl-2和Bax基因表达情况比较（）

*与Control 组比较，P＜0.05。

本文为了检验CaSR 表达在宫颈癌发生发展中的作用，笔者制备了C-33A 细胞移植瘤模型。结果显示，R568（CaSR 激动剂）对肿瘤的生长有明显抑制作用。给予裸鼠移植瘤模型组加入Calhex231（CaSR抑制剂）后，移植瘤生长速度明显增加，由此推断CaSR 可能参与此过程。MMP2 和MMP9 为基质金属蛋白酶家族主要成员，其不仅能够破坏基底膜而且能促进肿瘤组织周围血管形成，为肿瘤生长、肿瘤细胞增殖和侵袭提供便利条件[15-16]。ELISA 检测血清和C-33A 细胞培养基结果显示，R568 能够有效降低MMP2 和MMP9 含量水平，而Calhex231 作用相反。CCK-8 细胞活力实验和细胞划痕实验能分别反映细胞的增殖和迁移情况。在实验中，笔者发现R568 有明显抑制C-33A 细胞增殖和迁移的作用。

现有文献报道，当肿瘤细胞中E-cadherin 和β-catenin 蛋白形成复合体后[17-18]，能够增加肿瘤细胞黏附性使细胞增殖和迁移减慢；过度的VEGFR3表达能够增加肿瘤周围血管形成，进而供给其充足的生长血运，从而促进其生长和侵袭[19-20]。为明确CaSR 激活后抑制宫颈癌C-33A 细胞增殖和迁移的机制，笔者分别检测了瘤组织和细胞中CaSR、Bax、Bcl-2、E-cadherin、β-catenin 和VEGFR3蛋白表达情况。结果显示，R568 能够上调CaSR、Bax、E-cadherin 和β-catenin 的蛋白表达，下调Bcl-2 和VEGFR3 蛋白表达，Calhex231 有上述相反作用。这一结果和C-33A 细胞中Bcl-2 和Bax 基因表达趋势完全一致。此外，检测C-33A 细胞内Ca2+浓度变化趋势与CaSR 表达也相一致。

综上，据以上实验数据推断如下，CaSR 激活后可增加C-33A 细胞内Ca2+浓度，一方面促进E-cadherin 和β-catenin 蛋白表达并形成复合物，增加肿瘤细胞黏附性从而抑制细胞增殖和迁移；另一方面，抑制VEGFR3 表达能够减少肿瘤周围血管形成，阻止其生长和侵袭。此外，Ca2+浓度升高也可激活促凋亡基因表达诱导C-33A 细胞凋亡，然而，详细分子调控机制还需要后续实验逐一证实。