徐州市耐多药结核耐药分析及分枝杆菌基因突变特征研究

刘加彬,张瑞梅,刘成永

耐药结核的出现，给中国乃至世界的结核病诊疗与控制工作带来严峻挑战。世界卫生组织列出的30个高结核病负担国家在全球的病例中，印度占27%，中国占9%，中国位列全球第二[1]。中国结核病报告发病人数始终位居法定乙类传染病前列[2]。研究发现结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药与katG、inhA、aphC，利福平(RFP)与rpoB等相关耐药基因突变有关，并且不同的国家和地区结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点也不相同[3]。

我们的研究就是基于聚合酶链式反应(PCR)和反向点杂交(RDB)相结合的基因芯片技术,随机抽取徐州地区耐多药结核(MDR-TB)分枝杆菌，分析和发现本地区MDR-TB耐药情况和相关基因突变特征，为耐多药结核的快速诊疗和精准控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1数据来源 研究涉及的MDR-TB菌株115株，敏感菌株66株来自徐州市传染病医院、徐州市疾控中心及徐州市10县(市)、区结核病监测点实验室。菌株的传代、培养和保存均由徐州市传染病院完成。结核分枝杆菌标准株 H37RV 由中国结核病控制中心临床中心参比室提供。

1.2结核分枝杆菌改良罗氏比例法药物敏感试验[4]改良罗氏比例法培养基内含药浓度按照中国防痨协会推荐的耐药标准：INH(0.2 μg/mL)、RFP(40 μg/mL)、SM(4 μg/mL)、EMB(2 μg/mL)、KM(30 μg/mL)、OFX(2 μg/mL)。

1.3结核分枝杆菌鉴定 用对硝基苯甲酸(PNB)法[4]

1.4药敏培养基[4]抗痨药物异烟肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)、链 霉 素(SM)、卡那霉素(kanamycin，KM)均由徐州市传染病院提供。

1.5结核分枝杆菌耐多药基因芯片分析[5]结核杆菌(TB)全基因组有4 411 529 bp,约包括4 000个基因。研究发现TB耐药性的发生与其基因突变相关。正常情况下，TB的KatG蛋白和InhA蛋白使异烟肼活化成异烟酸，使之具有杀菌的能力。当katG、inhA基因发生突变时，过氧化氢-过氧化物酶、烯酰基还原酶活性下降或丧失，阻止异烟肼变成活性形式，从而导致TB对异烟肼产生不同程度的耐药。

利福平的耐药性95%以上是由编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变引起，突变均发生在rpoB509～533位的25个氨基酸(75 bp)组成的区域内。rpoB基因是细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因。当其中81个碱基的核心区域-耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，包括点突变或短的插入、缺失突变等，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚基结合，因而细菌表现为对利福平的耐受性。

本系统采用了聚合酶链式反应(PCR)和反向点杂交(RDB)相结合的基因芯片技术。设计引物扩增目的基因，引物一端标记有生物素，扩增好的产物都带有生物素标记。然后扩增好的目的基因片段与膜芯片上的探针特异结合，再通过链霉亲和素-过氧化物酶复合物与生物素结合，复合物在TMB作用和过氧化氢的催化下发生显色反应，扩增产物有与探针结合的位置都会产生蓝色圆点。MTB耐药突变基因检测芯片来自深圳亚能生物。

1.6芯片法检测位点[6]临床疑似肺结核患者分离培养结核分枝杆菌核酸的定性检测INH的katG、inhA和aphC基因各检测1个位点和RFP的rpoB基因检测6个位点。

1.7样本选择 对徐州地区2015-2018年结核病实验室耐多药菌株采取单纯随机抽样，结合徐州地区耐多药率计算样本数。数据录入采取EXCEL软件，数据统计采用SPSS 20.0进行t检验。

2 结 果

2.1耐多药情况 115例MDR-TB菌株耐药情况有9种组合，主要是以耐INH+RFP组合为主，比例为47.83%，其次为耐INH+RFP+SM组合，比例为20.00%，其他组合均占一定比例，见表1。

表1 徐州市耐多药菌株耐药分析

2.2 基因突变情况

2.2.1INH相关基因katG、inhA及aphC变情况分析 115例MDR-TB菌株检测出无基因突变14株，基因突变株101株，突变率87.83%。INH相关基因突变类型、例数和突变率分别为katG基因74例(64.35%)、inhA基因4例(3.48%)、katG+inhA双基因14例(12.17%)、katG+aphC双位点突变12.17%。见表2。在比例法研究敏感株66例中，有6例发生基因突变，突变率9.09%，主要突变基因inhA3例(4.55%)、aphC3例(4.55%)，见表3。MDR-TB菌株和敏感株总体变异率均数比较(t=107.56，P<0.05)，二者差异有统计学意义。单个基因变异率均数比较katG(P<0.05)，二者差异有统计学意义。inhA基因(t=5.04，P>0.05)、aphC基因(t=0.73，P>0.05)，二者差异无统计学意义，见表3。

表2 徐州市MDR-TB菌株INH相关基因突变分析

表3 徐州市MDR-TB菌株和敏感株的基因突变统计分析(INH)

2.2.2RFP相关基因rpoB突变分析 115例MDR-TB菌株检测出无基因突变16株，基因突变株99株，突变率86.09%。耐RFP 的相关rpoB基因突变位点类型和例数分别为 单531位点 52例(45.22%)、单516 位点 10例(8.70%)、单526位点 2例(1.74%)，531+516双位点突变16例(13.91%)、531+513双位点突变14例(12.17%)、516+533双突变位点1例(0.87%)。531+516+513三位点突变4例(3.48%),见表4。在比例法研究敏感株66例中，有8例发生基因突变，突变率12.12%，主要突变单513位点、单526位点，见表5。MDR-TB菌株和敏感株总体变异率均数比较(t=94.92，P<0.05)，二者差异有统计学意义，531(P<0.05)、516(P<0.05)、533(P<0.05)二者比较差异均有统计学意义。513(t=5.04，P>0.05)、526(t=2.43，P>0.05)二者比较差异均没有统计学意义。512二者均未检出突变，见表5。

表4 徐州市MDR-TB菌株RFP相关基因突变分析

表5 徐州市MDR-TB菌株和敏感株的基因突变分析(RFP)

2.2.4MDR-TB菌株基因突变初复治分层分析 通过对115例MDR-TB菌株以患者初复治分层分析，二者无论是异烟肼，还是利福平，突变情况比较仅inhA(t=4.06，P<0.05)突变有统计学意义，见表6。

表6 徐州市MDR-TB初复治患者菌株基因突变变化统计分析

3 讨 论

耐多药结核病的发生和流行，无论是对中国还是世界的结核病控制与诊疗带来挑战。在WHO比尔·盖茨项目资金的支持下，为MDR-TB患者实施了免费医疗，耐多药结核发病率有所下降，但形势依然严峻。

本研究结果发现耐多药有9种组合，主要是以耐INH+RFP组合为主，比例为47.83%，其次为耐INH+RFP+SM组合，比例为20.00%，其他组合均占一定比例。这结果与其他地区有差异，主要原因与徐州地区的化疗方案有关，席向宇等[10]研究也发现这一现象。

本研究利用MTB耐多药突变基因检测芯片检测了徐州市115株MDR-TB的INH相关katG、inhA及aphC因。115例MDR-TB的耐INH相关检测出无基因突变株14株，基因突变株101株，突变率87.83%。INH相关基因突变类型及例数分别为katG基因74例(64.35%)、inhA基因4例(3.48%)、katG+inhA双基因14例(12.17%)、katG+aphC双位点突变12.17%。与66例敏感株发生6例突变，总突变率9.09%。主要突变基因inhA3例(4.55%)、aphC3例(4.55%)，二者差异有统计学意义，这充分说明耐多药基因突变的客观性，检测突变基因对临床用药指导有明显的指导意义。katG基因单位点突变率(64.35%)与浙江地区[11](69.3%)等报道相似；与中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室陈燕等[3]研究(84.0%)、深圳地区[12](84.6%)、福建[13]等地报道区别较大，这说明katG315 突变存在一定的地区差异。katG+inhA基因(12.17%)、katG+aphC双位点突变12.17%突变与陈燕等[3]研究也有比较大的区别。无论单个基因还是联合多个基因变异均表现地区间差异，原因应该进一步分析。MDR-TB菌株和敏感株总体变异率均数比较(t=107.56，P<0.05)，二者差异有统计学意义。katG基因(P<0.05)二者差异有统计学意义。inhA基因(t=5.04，P>0.05)、aphC基因(t=0.73，P>0.05)，二者差异无统计学意义。研究表明katG基因突变相对稳定，有较强的临床应用价值，可作为耐药诊断的指标。inhA、aphC因突变表现出不稳定性，仅对临床有参考意义。

本研究利用MTB耐多药突变基因检测芯片检测徐州市115株MDR-TB的RFP相关rpoB基因。115株MDR-TB菌株检测出无基因突变16株，基因突变株99株，突变率86.09%。RFP相关rpoB基因突变位点类型和例数分别为单531位点52例(45.22%)、单516位点 10例(8.70%)、单526位点 2例(1.74%)、单533、513、512位点没有检出，531+516双位点突变16例(13.91%)、531+513双位点突变14例(12.17%)、516+533双突变位点1例(0.87%)。531+516+513三位点突变4例(3.48%)。突变以531、516位点为主，531+516、531+513双位点突变，531+516+513三位点突变均有检出，徐州市RFP相关rpoB基因突变位点类型表现出多样性。耐多药株与敏感株突变位点也存在差异，敏感株发生突变的513、526位点，在耐药株中很少检测到。本研究单531位点(45.22%)与陈燕等[3]研究检测结果(49.3%)相似，但其他单位点、多位点差异较大表现出地区差异。敏感株66例中，有8例发生基因突变，突变率12.12%，主要突变单513位点、单526位点，与陈燕等[3]研究敏感株的无任何突变的检测结果有差异。MDR-TB菌株和敏感株总体及单个位点变异率均数比较t=94.92，P<0.05，二者差异有统计学意义，531(P<0.05)、516(P<0.05)、533(P<0.05)二者比较差异均有统计学意义。513(t=5.04，P>0.05)、526(t=2.43，P>0.05)，二者比较差异均没有统计学意义。512二者均未检出突变，本研究表明rpoB基因531、516、533位点突变相对稳定，有较强的临床应用价值，可作为耐药诊断的指标。513、526、512位点突变表现出不稳定性，仅对临床有参考意义，其应用价值有待进一步研究。

综上所述，徐州市MTD-TB患者耐药情况地区特征清晰，与耐INH或RFP相关基因突变客观存在，并表现出多态性和地区性。与耐INH相关基因katG、与耐RFP相关基因rpoB531、516和533位点基因突变稳定，可为MTD-TB诊断指标体系建立提供科学依据，将为徐州市MTD-TB精准而快速诊疗和控制提供帮助。

利益冲突：无