菌糠生物炭对污灌区土壤Cu形态及甜菜生理特性的影响

张国胜，闫 梦，程红艳，张海波，王効挙，常建宁，黄 菲，何小芳，苏 龙，高健永

(1.山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 城乡建设学院，山西 太谷 030801; 3.日本埼玉环境科学国际中心，日本 埼玉347-0115)

Cu是植物正常生长所必须的8种微量元素之一，直接或间接参与植物的各项生命活动[1]。Cu同时也是一种重金属，广泛应用于化工及制造业。含Cu废水的不合理排放[2]，易造成土壤Cu含量超标。Cu胁迫下植物生长代谢紊乱，具体表现为植株生长缓慢、叶片失绿、光合和呼吸作用紊乱[3]。植物根部吸收土壤中的Cu后，经过食物链的富集作用，进而对人体健康产生危害。

生物炭通常是指生物质在完全或部分限氧的条件下，经过高温(<700 ℃)热解产生的富含碳素的多孔性材料[4]。生物炭还具有稳定、难溶[5]、表面积巨大、芳香性高、阳离子交换量大、含氧官能团丰富等独特的表面化学性质[6]。研究表明[4,7-9]，生物炭不仅可改善土壤理化性质，也对土壤重金属有良好的吸附钝化能力，且因生物炭来源广泛、成本低廉、环境友好而广受科研人员的青睐。

菌糠通常是指生产食用菌后剩下的培养产物。我国是食用菌生产和消费大国，2017年食用菌总产量3 712万t，据估算，每年将产生菌糠约6 000万t[10]。菌糠中含有大量的半纤维素、纤维素和矿物质等营养元素，具有较大的利用空间[11]。传统上，菌糠除少数用作肥料和饲料外，大部分被废弃[12]，不仅浪费资源，也造成了环境污染。近年来，随着食用菌产业的升级壮大，菌糠的资源化利用以及如何有效处理废弃菌糠成了亟需解决的问题[13]。刘冉等[14]利用黑木耳菌糠堆肥发酵制备有机肥，结果表明，菌糠有机肥可显著提高土壤的肥力水平，对小白菜的生长有显著的促进作用。黄菲等[15]以炭基有机肥配施菌糠木醋液，研究其对土壤中Cu形态的转化，结果表明，配施菌糠木醋液可有效降低土壤中可交换态Cu的含量。LIU等[16]对比菌糠与堆肥菌糠对水溶液中铅离子的影响，发现堆肥处理可提高菌糠去除铅离子的能力及去除速率。当前，以菌糠作为吸附剂和肥料的研究已有报道，而以菌糠制备生物炭作为环境修复材料的研究却鲜有报道。

因此，本研究以废弃猴头菇菌糠为原料制备生物炭，通过温室盆栽试验，首先研究不同用量菌糠生物炭对污灌区Cu污染土壤理化性质、Cu形态和甜菜生理特性及铜吸收的影响，进而探讨菌糠生物炭修复土壤重金属污染的可行性，为菌糠的绿色发展提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2019年3月在山西农业大学资源环境实验站温室大棚中进行。供试甜菜由太谷县巨鑫实验基地提供。

供试土壤采自山西省晋中市祁县某污灌区大田。土壤类型为石灰性褐土，土壤基本性质：pH值7.89、有机质含量19.64 g/kg、碱解氮含量86.43 mg/kg、速效磷含量141.68 mg/kg、速效钾含量267.56 mg/kg、全Cu含量427.88 mg/kg(超过了国家土壤环境质量三级标准400 mg/kg)。

供试生物炭的制备：新鲜猴头菇菌糠原料由山西农业大学食用菌中心提供。将新鲜菌糠风干后去除杂物，经高速粉碎机粉碎后过0.5 mm筛，60 ℃烘干后，保存备用。烘干后的菌糠在氮气保护下通过马弗炉，并以15 ℃/min的速率升温至500 ℃后保持2 h，自然冷却后取出，研磨过0.149 mm筛后，保存备用。制备的生物炭：pH值8.95、全氮含量11.41 g/kg、全磷含量10.50 g/kg、全钾含量10.65 g/kg。

1.2 试验设计

本试验采用完全随机区组设计，设置4个处理，生物炭施用量为风干土质量的0%、0.5%、1.0%、2.0%，每个处理重复3次，共12盆。每盆装入风干过筛后的土壤2.5 kg，每盆中植入3株长势相同的甜菜幼苗。在试验进行期间，每天傍晚每盆浇水200 mL，定期处理杂草，天气炎热时酌情增加浇水量，并及时通风散热，以保持甜菜的正常生长。待甜菜生长8周后收获，收获后植株分为地上部分和根系部分，分别用自来水和蒸馏水冲洗，以吸水纸擦干后测株高和鲜质量，再经105 ℃杀青、60 ℃烘干，置于自封袋中密封待测。以土钻取0～20 cm土样，风干后过2 mm筛，置于自封袋中保存待测，同时以玛瑙研钵研磨过0.149 mm筛土样。各处理编号设置：CK、0.5%H、1.0%H、2.0%H，分别加入生物炭 0、12.5、25.0、50.0 g/盆。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤理化性质的测定 土壤pH值采用玻璃电极法测定(水土质量比10∶1)；有机质含量用重铬酸钾容量法测定；速效磷含量用0.5 mol/NaHCO3浸提-钼蓝比色法测定；碱解氮含量用碱解扩散法测定；速效钾含量用NH4OAc浸提-火焰光度法测定。

1.3.2 土壤酶活性的测定 碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定；蔗糖酶活性用3，5-二硝基水杨酸比色法测定；脲酶活性用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定。

1.3.3 土壤重金属含量的测定 土壤重金属含量采用HNO3-HF-HClO4三酸法消解，原子吸收光谱仪测定。重金属形态(弱酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态)分析采用BCR提取法测定[17]。甜菜样品重金属含量用HNO3-HC1O4混合酸法消解，电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定。

1.3.4 甜菜生理生化指标的测定 叶绿素含量用丙酮-乙醇混合液(V1∶V2=80%∶20%)提取、分光光度法测定；株高及鲜质量分别用卷尺和电子天平测定。

1.3.5 抗氧化指标的测定 超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮蓝四唑法测定；过氧化物酶(POD)活性用愈创木酚法测定；过氧化氢酶(CAT)活性用紫外吸收法测定；丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸-分光光度法测定。

据调查，农村幼儿园两教一保、两教两保的比例合计仅为5.46%，师幼比1∶10以下幼儿园也仅为3.64%，具有事业编制的教师比例为1.82%，持有教师资格证者为36.36%，小学高级职称和一级职称教师占比都是0.00%。可见，农村幼儿教师不仅数量缺口巨大，而且优质教师资源缺乏严重。

1.3.6 计算公式 富集系数(BCF)∶BCF=Cr/Cs,转移系数(TF)∶TF=Cf/Cs(Cr代表甜菜根中铜含量，Cs代表土壤中铜含量，Cf代表甜菜地上部分铜含量)。

1.4 数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2016绘制数据表格，使用SPSS 21.0进行方差分析、差异显著性分析，采用软件Origin 9.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对污灌区土壤理化性质的影响

由表1可知，随着生物炭的施用，土壤pH值均有不同程度的增加。与CK相比，0.5%H和1.0% H处理pH值增加不显著，2.0%H处理下pH值增加了0.22，增加显著。与CK相比，0.5%H、1.0%H、2.0%H处理的有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量均显著增加。有机质含量分别增加4.3%、15.6%、28.7%，碱解氮含量分别增加3.3%、7.5%、17.1%，速效磷含量分别增加9.5%、25.4%、45.8%。施用生物炭后土壤速效钾的含量增长最为明显，增幅分别为45.6%、75.7%、174.1%，增幅均值为98.5%。

表1 不同处理对污灌区土壤理化性质的影响

2.2 不同处理对污灌区土壤酶活性的影响

由表2可知，与CK相比，生物炭的施用可以在一定程度上提高过氧化氢酶、脲酶的活性，但处理之间差异均不显著，在2.0%H处理时两者分别增加了1.5%、6.9%。施用生物炭后，甜菜中碱性磷酸酶、蔗糖酶活性均有不同程度的增加，2.0%H处理下增幅最显著，与CK相比，两者分别增加了16.0%、24.3%，而在0.5%H和1.0%H处理下两者增幅均不显著。

表2 不同处理对污灌区土壤酶活性的影响

2.3 不同处理对污灌区土壤Cu形态的影响

由图1可知，CK中Cu的形态主要由可还原态(占比37.3%)和残渣态(占比45.1%)组成。施入生物炭后，Cu的各形态均发生一定程度的转化，其中以可还原态和残渣态的变化为主导，可还原态的占比减少，分别由37.3%降低至32.5%、30.2%、24.9%；残渣态的占比增加，分别由45.1%增加至49.7%、52.9%、57.5%。

图1 不同处理对土壤中Cu形态占比的影响

由表3可知，与CK相比，当施用生物炭量到2.0%时，各形态Cu含量的变化均显著，弱酸提取态、可还原态Cu含量分别由49.81、161.96 mg/kg下降至35.77、105.97 mg/kg，降幅分别为28.2%、34.6%；可氧化态、残渣态Cu含量分别由26.61、196.21增加至39.44、244.94 mg/kg，增幅分别为48.2%、24.8%。

表3 不同处理污灌区土壤Cu形态及含量

2.4 不同处理对甜菜生长状况的影响

由表4可知，随着生物炭施用量的增加，甜菜株高、鲜质量和叶绿素含量呈先增加后减小的趋势，且1.0%H处理增幅最大。在1.0%H和2.0%H处理下，甜菜的株高和鲜质量相比CK显著增加，分别增加23.4%、27.4%和15.37%、21.0%，且两处理间株高和鲜质量差异不显著，而0.5%H处理与CK之间无明显差异。与CK相比，不同处理下叶绿素含量均有不同程度增加，其中，在1.0%H处理时叶绿素含量最大，较CK显著增加71.4%。

2.5 不同处理对甜菜抗氧化指标的影响

由表5可知，施入不同用量的生物炭后，甜菜中的SOD、POD、CAT活性均显著降低，并且随着施用量的增加逐渐降低。与CK比较，2.0%H处理降低幅度最大，植株中的SOD、POD、CAT活性分别降低了48.1%、54.3%、41.9%。与CK处理相比，不同生物炭处理的MDA含量均显著下降，分别下降了15.7%、29.7%、37.3%，各处理之间差异显著。

表5 不同处理对甜菜抗氧化指标的影响

2.6 不同处理对甜菜Cu吸收的影响

由图2可知，施用生物炭的处理均可显著降低甜菜地上部分和根系中Cu含量，表现为随着施用量的增加降幅越大。与CK相比，2.0%H处理甜菜地上部分和根系中Cu含量由27.75、50.45 mg/kg到14.75、19.92 mg/kg，降幅分别为46.9%、60.5%。

不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同

2.7 不同处理对甜菜根系BCF、TF值的影响

由表6可知，不同生物炭处理下，甜菜根系BCF值均呈下降趋势，与CK相比，0.5%H处理下降不显著，1.0%H处理和2.0%H处理下降显著，分别下降了7.6%、34.7%、60.2%。随着生物炭的施用，TF值表现为先减后增，大小依次为：2.0%H处理> 1.0%H处理>CK>0.5%H处理。与CK相比，0.5%H和2.0%H处理的TF值分别降低和增加了8.5%、37.5%。

表6 不同处理对甜菜根系BCF、TF值的影响

3 结论与讨论

原料和制备工艺的不同，使制得的生物炭的种类繁多，性质上也有一定的差异。与多数研究中一样，本研究所施加的猴头菇菌糠生物炭的pH值也呈碱性(pH值为8.95)，可能是因为在菌糠的热解过程中，酸性官能团裂解成为灰分，同时碳酸盐和无机碱盐的相对含量随着热解温度升高而不断累积，使制得的生物炭pH值升高[18]。一些研究显示，生物炭可以提高土壤pH值，降低土壤酸化问题。本研究中，施用0.5%、1.0%的菌糠生物炭对土壤pH值影响不显著，这可能与土壤本身呈碱性(pH值为7.89)有关[8]。

生物炭具有疏松多孔状的性质，施入土壤后土壤孔隙状况得到了改善，促进了土壤有机质的分解和释放，同时生物炭中含有大量不易分解的有机碳，也可增加土壤有机质的含量。以猴头菇为原料的生物炭中还含有各种有机、无机形式的氮素，可以提高土壤氮素养分的供应。张沙沙等[19]认为，生物炭促进了土壤磷的活化，使闭蓄态磷转化为活化态。也有研究认为，因阳离子桥键间接的作用[20]，土壤中的磷被生物炭吸附。徐艳[21]发现，当与施用5%生物炭相比，生物炭施用量较高时(10%)土壤速效磷含量有略微的下降。本研究中，添加生物炭后土壤速效磷、钾含量呈显著升高，可能是因为未施入较多的生物炭。同时以菌糠制备的生物炭中含有丰富的磷素、钾素[22](全磷含量10.50 g/kg，全钾含量10.65 g/kg)，施入后可显著提升速效磷、速效钾养分的供应。

土壤酶活性与土壤微生物密切相关。本研究中，施用较低量(0.5%)生物炭对4种土壤酶活性均无显著影响。当施用量增至2.0%时，碱性磷酸酶、蔗糖酶的活性有显著提升。李佩[23]研究显示，单施用菌糠可以显著增加土壤酶活性，而施用菌糠生物炭时，土壤酶的活性增加不显著，这与本研究的结果类似。生物炭对土壤酶的影响较为复杂，一方面可以促进土壤酶活性提高，可能是因为生物炭可以吸附土壤中的反应底物，促进酶促反应进行[24]。另一方面又会对酶促反应有抑制，可能是因为生物炭可以吸附土壤中的酶分子，对酶促反应结合位点形成保护[25]。

土壤重金属含量可以用来直观地评价土壤受重金属污染的程度，而不能用来反映重金属的生物有效性。因此，本研究使用BCR提取法研究土壤Cu的形态变化。弱酸提取态Cu移动性强，可直接被植株根系吸收，在一定条件下，可还原态、可氧化态Cu可转换为弱酸提取态。而残渣态Cu最为稳定，通常不被植株吸收[15]。本研究中菌糠生物炭显著提高了植物难利用的残渣态Cu占比。诸多研究表明，一方面，生物炭通过提高土壤pH值来影响Cu的有效性[26]，另一方面，生物炭中含有丰富的含氧官能团[27]，能与Cu离子发生络合或鳌合反应[28]。同时，生物炭有较高的比表面积，对Cu离子也有一定的吸附作用。

已有多数研究表明，适当的施用生物炭可以改善土壤理化性质，对植物的生长有促进作用[29-31]。本研究中，添加1%的菌糠生物炭显著增加了甜菜的株高、鲜质量。当施用量升至2.0%时，促进效果减弱，促进效果表现为1.0%H>2.0%H>0.5%H，叶绿素含量也表现为相同的促进效果。生物炭对作物生长及产量的影响，因生物炭自身性质的差异、施用量的多少和配施方式的不同、供试作物的生物学性质、胁迫类型[32]、供试土壤的水肥条件以及土壤的类型不同而有一定的差异。郭茹等[33]通过蚯蚓粪配施生物炭，发现在施用8.0%的蚯蚓粪处理上，施用7.2%的小麦秸秆生物炭显著增加了生菜生物量，而在4.0%蚯蚓粪处理中，则表现为随着生物炭施用量的增加(2.4%、4.8%、7.2%)生菜生物量显著减少。更高量生物炭的施用，修复土壤重金属污染的效果可能会更佳。但过量的生物炭可能会对甜菜产生毒害作用，导致质量和产量降低。陈芳等[34]认为，在土壤中施用过量的生物炭，使得吸附能力过强，养分固定和释放不协调，导致有效态养分降低，不利于作物的生长。平森文等[35]结合施用效果认为，施用生物炭量应控制在5%以内，以3%施用量为宜。

重金属胁迫条件下，植物会通过提升抗氧化酶活性来增强对逆境的抵抗力[36]。本研究中，CK甜菜在高含量的Cu胁迫下，吸收了过量的Cu而发生细胞质膜损伤，SOD、PDO活性都在较高水平，且显著高于其他处理。这是因为在Cu胁迫下，甜菜体内含氧自由基含量增多，为抵御体内含氧自由基的产生，植物体内的抗氧化酶活性增强。MDA含量可以体现植物在不利条件下的损伤程度[37]，是细胞膜脂质过氧化程度的反映[36]。本研究发现，随着生物炭施用量的增多，甜菜细胞内抗氧化酶活性和MDA含量不断降低，说明甜菜质膜损伤程度不断降低。生物炭可以使土壤Cu的生物有效性降低，甜菜根系Cu吸收的含量也相应降低，质膜的损伤程度降低，从而使相应的抗氧化酶活性和MDA含量也降低。BCF和TF值可以更直观看出甜菜根部吸收和转移铜的能力[39-44]。本研究中甜菜根BCF值不断降低，表明随着生物炭的施用,甜菜对Cu的富集不断降低，各处理的TF值均小于1，说明甜菜中的Cu主要富集在根系，这与甜菜根的生理特性有关。

总的来说，菌糠生物炭的施用可以提升土壤有机质和速效磷、钾的含量，整体上促进土壤酶活性提升，减轻甜菜重金属胁迫，促进甜菜的生长，同时可以促进Cu向残渣态的转化，施入土壤后对甜菜的种植和修复土壤重金属Cu污染有一定的积极作用。结合甜菜生长状况及重金属去除效果，施用2.0%的猴头菇菌糠生物炭能达到理想的效果。