磨损颗粒诱导炎性骨溶解经TLR信号通路调控影响的实验研究

陈德胜，张 晨，宋国瑞，刘子歌，郭凤英，李 燕

髋关节骨性关节炎、强制性脊柱炎合并强直髋、股骨头无菌性坏死等髋部病变是骨科常见关节疾患，临床上通常表现为关节疼痛、肿胀、步态异常，功能障碍等[1-2]。人工全髋关节置换术是治疗髋关节中晚期病变最为理想的治疗方法[3]。而无菌性松动导致的假体周围骨溶解是术后最严重的并发症之一[4]。假体部件互相摩擦不断磨损从而产生磨损颗粒在骨-假体的界膜组织内激活巨噬细胞，导致释放出肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等多种炎性介质和细胞因子，引起无菌性炎性反应，诱导破骨细胞增殖、成熟、活化，引起假体周围骨溶解反应[5-6]，使得假体松动、下沉，因而必须行人工关节翻修手术。磨损颗粒如何引起无菌性炎性反应，从而出现假体周围骨溶解是当前有待于研究的热点。有研究证实[7]，磨损颗粒可引起适应性免疫反应，主要由巨噬细胞参与的固有免疫反应。适应性免疫与固有免疫在磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解过程中有重要的参与作用，与巨噬细胞、破骨细胞、淋巴细胞及其趋化因子调控的信号通路关系密切。Toll样受体(TLR4)与之关系密切[8]。本文在构建钛颗粒刺激小鼠植骨气囊诱导骨溶解动物模型时，观察TLR4抑制剂TAK-242(瑞沙拖维)对于钛颗粒刺激小鼠植骨气囊诱导骨溶解的影响，以寻求预防和延缓无菌性松动的方法和手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选用磨损颗粒的钛颗粒购于美国Alfa Aesar公司，颗粒要求的大小平均直径小于20 μm。内毒素检测试剂盒购于厦门市鲎试剂实验厂有限公司，TLR4选择性抑制剂TAK-242(瑞沙拖维)购于杭州联科生物技术股份有限公司，TLR4及TNF-α一抗抗体购于美国Sigma公司。

1.2 实验动物：选用雌性SPF级BALB/c小鼠体重在28～35 g，10～12周龄，健康状况良好，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物实验均在宁夏医科大学实验动物中心SPF级动物房完成。动物实验经宁夏医科大学实验动物管理和使用委员会审批通过，符合动物伦理要求。

1.3 实验方法

1.3.1 磨损颗粒的内毒素去除处理和检测：钛颗粒置于烘烤燥箱内在180 ℃下焙烤6 h，浸泡于70%乙醇，再离心、沉淀，反复多次进行循环此操作，加PBS液洗涤、离心、干燥，通过紫外线持续照射消毒，配制成钛颗粒悬液放置于4 ℃温度下。钛颗粒悬液需经过内毒素检测，按照内毒素检测试剂盒说明书的程序进行测试后备用。

1.3.2 小鼠air pouch气囊植骨动物模型建立方法：将小鼠腹腔麻醉成功后，小鼠背部消毒备皮，注射2 mL无菌空气形成气囊；之后连续每天向小鼠背部气囊中注射0.5 mL无菌空气，至第7天air pouch气囊形成；另外随机选同属同龄小鼠处死，取出颅骨骨片，分成两部分，每部分可以做一个植骨供体。切开气囊，植入小鼠颅骨骨片，缝合切口。

1.3.3 动物模型分组和处理：将60只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)和TLR4抑制剂组(C组)，每组20只。另选30只SPF级BALB/c同属同龄雌性小鼠，作为磨损颗粒诱导骨溶解动物模型植骨的供体，每只小鼠可提供两片用于植骨的颅骨骨片，大小约0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm。对照组(A组):植骨后小鼠气囊内立即注射0.1 mL PBS液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理盐水，持续14d。模型组(B组):植骨后小鼠气囊内立即注射 0.1 mL处理好的钛颗粒悬液，每日1次腹腔注射0.1 mL生理盐水，持续14 d。TLR4抑制剂组(C组)：植骨后小鼠气囊内立即注射 0.1 mL处理好的钛颗粒悬液，每日1次腹腔注射200 mg/kg TLR4抑制剂 TAK-242，持续14 d。之后将3组动物在同一时间段处死，取出小鼠颅骨及其囊壁组织(植骨气囊复合体)。取出的小鼠颅骨及其囊壁组织经12.5% EDTA脱钙液脱钙，至少需要2周；经自动脱水机处理后进行石蜡包埋，制成蜡块。用切片机切皮，每片4 μm，捞片到载玻片上。

1.3.4 苏木素-伊红(H-E)染色：切片先后置入不同浓度的二甲苯、无水乙醇及酒精中浸泡，之后用蒸馏水洗涤；加苏木素染色，自来水冲洗，盐酸酒精分化，自来水冲洗，用0.6%氨水返蓝，流水冲洗；置入伊红染液染色；置入不同浓度酒精、无水乙醇及二甲苯脱水透明；中性树胶封片。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：将切片二甲苯脱蜡后，依次经过不同浓度乙醇脱水，双蒸水冲洗；丙酮溶液固定，双蒸水冲洗；放入暗盒内，加入新鲜配制 TRAP 染液，37 ℃水浴锅避光孵育 1 h；双蒸水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗，中性树胶封片。

1.3.6 免疫组织化学染色：切片在68 ℃中烤2 h 后入不同浓度二甲苯、无水乙醇浸泡，自来水、蒸馏水冲洗；3% H2O2孵育，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液煮沸予抗原修复，滴加羊血清于玻片封闭，PBS液冲洗，滴加一抗(TLR4，TNF-α)孵育，4 ℃ 过夜，PBS冲洗，滴加酶标二抗，37 ℃ 孵育，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉抗生物素蛋白稀释液，37 ℃ 孵育，滴加DAB液静置数分钟，置于显微镜下观察显色，适时终止，冲洗，苏木素液复染，1%盐酸酒精分化，碳酸锂返蓝，不同浓度的乙醇、二甲苯浸泡，中性树脂封片。3组免疫组化染色切片通过显微镜下观察结果并进行图像采集，每张免疫组化切片随机选取5个表达的高倍镜(10×40)视野，需确保每张图像的位置以及背景亮度一致。将采集图像运用Image-Pro软件进行分析，确定统一的测定标准，计算分析后得到平均光密度值。

2 结果

2.1 苏木素-伊红(H-E)染色：H-E染色结果，对照组中未见钛颗粒浸润，植骨气囊复合体周围组织见少量的中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等，炎症反应不明显，植骨块骨面平滑且光整；模型组植骨气囊复合体的囊壁增厚，周围钛颗粒浸润，有中性粒细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞等浸润，炎性反应显著，植骨块表面存在侵蚀，骨面不光整，部分有缺损表现。TLR4抑制剂组亦有钛颗粒浸润，植骨气囊复合体周围气囊组织厚度与模型组比相对较薄，周围有少量炎性细胞，植骨骨块表面侵蚀反应减轻，比较平整。

2.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)：对照组见少量的TRAP染色阳性细胞，染色较浅，阳性染色面积小；模型组TRAP染色阳性细胞数目比较多，阳性染色面较大，而且染色深；TLR4抑制剂组TRAP染色阳性细胞数目与模型组比较少(图1,目录后)。TRAP染色阳性细胞数目统计，模型组TRAP染色阳性细胞数目(18.105±1.641)个显著高于对照组(8.278±0.9515)个(P<0.05)，而TLR4抑制剂组TRAP染色阳性细胞数目(13.102±1.532)个相对于模型组差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组TRAP染色阳性细胞数目比较

2.3 小鼠气囊组织中TLR4免疫组织化学染色：对照组植骨气囊复合体周围囊壁组织中可见TLR4染色阳性细胞，阳性染色相对较浅；模型组植骨气囊复合体周围囊壁组织中可TLR4染色阳性细胞数目多，阳性表达比较高；而TLR4抑制剂组中TLR4染色阳性细胞数目及阳性表达与模型组相比而言都减少(图2，目录后)。模型组TLR4阳性表达(0.113±0.010)显著高于对照组(0.042±0.012)(P<0.05)，而TLR4抑制剂组TLR4阳性表达(0.069±0.012)相对于模型组(P<0.05)显著减少，见表2。

表2 3组TLR4免疫组化表达比较

2.4 小鼠气囊组织中TNF-α免疫组织化学染色：对照组中可见少量的TNF-α染色阳性细胞，阳性染色较浅；而模型组TNF-α染色阳性细胞数目显著增多，阳性表达较高；TLR4抑制剂组中TNF-α染色阳性细胞数目及阳性表达均较少(图3-图4，目录后)。

3组免疫组化结果运用Image-Pro软件进行分析后，统计结果如下，模型组TNF-α阳性表达(0.131±0.204)显著高于对照组(0.033±0.112)(P<0.05)，而TLR4抑制剂组TNF-α阳性表达(0.080±0.085)相对于模型组(P<0.05)显著减少，见表3。

表3 3组TNF-α免疫组化表达比较

3 讨论

假体周围骨溶解导致的无菌性松动是人工关节置换术后最为严重的并发症之一，也是人工关节置换术后假体松动、下沉、失败最主要的影响因素。因此，患者常需要经历多次反复人工关节翻修手术，给患者个人造成严重的痛苦，也给社会带来极大的经济负担[9]。目前研究表明[5]，磨损颗粒刺激人工关节的界膜组织巨噬细胞、破骨细胞、淋巴细胞等会引起一系列无菌性炎性反应的生物学改变，激活破骨细胞，出现假体周围骨溶解的人工关节无菌性松动。

参与上述病理改变的破骨细胞分化、增值、成熟由多个信号通路如 NF-κB、ERK、JNK、p38MAPK、PI3K/AKT 等参与，通过单一或者协同作用来调控破骨细胞骨溶解作用。而Toll样受体(TLR)或其他模式识别受体信号通路可以介导活化的NF-κB、ERK、JNK、p38MAPK信号通路而调控无菌性炎性反应[10]。

TLR是一种最早被提出能识别细菌和其他病原体分子相关的一种模式识别受体(PRR)，被用来识别病原相关分子模式(PAMP)以及损伤相关分子模式(DAMP)，在宿主防御入侵的病原体过程中有关键性作用[11]。TLR是所有PRR中最具特征的代表。TLR属于I型跨膜糖蛋白(type I transmembrance protein)，能识别病原微生物进化中保守分子，如脂多糖、肽聚糖、病原微生物等的核酸。到目前为止，已发现人体内有TLR1～10，10个TLR受体。TLR2和TLR4的配体能识别大部分革兰氏菌相关的配体，包含了绝大多数对人体致病的微生物类别，在人体TLR家族中最为重要[12]。TLR4 是第一个被识别的Toll样受体，可以特异性识别并结合革兰阴性菌细胞壁的脂多糖，从而激活核因子κB(NF-κB)，进一步促进TNF-α、IL-6 等炎性因子的激活，引起一系列内源性免疫反应，最终导致组织器官损伤。人工关节置换术后各关节部件之间摩擦产生的磨损微粒能够通过髓样分化蛋白88(MyD88)依赖途径激活巨噬细胞表面的TLR，启动活化的NF-κB信号通路等从而释放各种促炎因子，激活破骨细胞分化成熟，从而造成骨代谢的失衡，导致骨溶解的形成[13-14]。TLR在人工关节无菌性松动的发病过程中有着极其重要的作用。此外，TNF-α是机体介导炎症反应的关键炎性介质，当磨损颗粒刺激巨噬细胞后，TNF-α协同巨噬细胞释放多种炎性介质和细胞因子的产生及释放，发挥“级联放大”的作用，在整个炎症反应中，TNF-α有着重要的始动作用[15]。此外，作为炎症反应相关的细胞因子，TNF-α也能激活TLR2和TLR4，并进一步促进释放多种炎性因子[16]。

本实验是在小鼠磨损颗粒诱导骨溶解模型基础上，选用TLR4抑制剂TAK-242作用于该动物模型。病理学观察结果显示，TLR4抑制剂TAK-242可以减轻钛颗粒刺激小鼠入air pouch植骨气囊中炎性反应；TRAP染色结果也证实，TLR4抑制剂TAK-242可以减少钛颗粒刺激后破骨样细胞的阳性细胞数目及阳性表达范围。这些组织形态学改变表明：通过下调TLR信号通路，磨损颗粒诱导骨溶解模型中的炎性因子数目减少，炎性反应在一定程度上得到了减轻。在免疫组化中TLR4抑制剂TAK-242作用下植骨气囊复合体中TLR4和TNF-α的阳性表达明显降低，说明下调TLR信号通路，可使活化的NF-κB信号通路等作用降低，也进一步减少了促炎性因子的释放，影响了破骨细胞分化成熟，使得骨溶解的作用减弱。与此同时，经下调TLR信号通路，TNF-α协同巨噬细胞释放多种炎性介质和细胞因子的产生及释放的作用也受到抑制，同时TNF-α对TLR2和TLR4激活作用减弱，释放多种炎性因子作用也相应减弱。

综上所述，TLR信号转导通路在无菌性炎性骨溶解中发挥了重要作用。通过对TLR信号转导通路的MyD88依赖途径的调控，可能对NF-κB信号通路等激活作用减弱，阻止了炎性因子释放，抑制破骨细胞分化成熟，从而延缓炎性骨溶解发生、发展。