热应激对小鼠卵巢发育的影响

高 扬，李 卉，刘晓兵，马 波，马 云，宋 辉,2

卵巢的正常发育是雌性动物生殖能力的重要保证，其中卵泡发育与雌性动物的发情周期、卵母细胞质量以及受精成功率和胚胎成活率密切相关[1]。有研究证明，热应激会导致雌性动物卵巢功能减退，生殖激素分泌水平下降进而引起发情延迟或不发情，受胎率和产仔率下降等危害[2-6]。在正常生理环境下，卵泡发育主要受下丘脑-垂体-卵巢轴分泌激素的调控[7]。当受到热应激刺激后，雌性动物下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)减少，垂体分泌的卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)受到抑制，卵泡发育受阻，继而影响卵母细胞质量，降低生殖潜能[8-9]。本研究以雌性幼年ICR小鼠为研究对象，模拟午后高温环境，观察热应激对小鼠生长各个阶段卵巢发育、卵泡闭锁以及发情周期的影响，为研究热应激对雌性动物生殖发育的影响提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：动物术后保温箱(中国玉研仪器，型号：5103)，电子天平(上海精科，型号：FA2004B)，石蜡切片机(Leica，型号：RM2235)，显微镜(Olympus，型号：U-RFL-T)，HE染色试剂盒(碧云天公司，货号：C0105)，PBS缓冲液(Solarbio，货号：P1020-500 ml)，多聚甲醛(Solarbio，货号：P1110-500 ml)，无水乙醇、二甲苯、载玻片、盖玻片、枪头、离心管等试剂耗材均购自银川伟博鑫生物科技有限公司。

3.4 本研究意义及局限 本研究编制了综合医院护士工作满意度量表，共包含2个维度16个条目，并进行了信效度的检验。本量表的编制过程符合量表开发流程，并且经过初步的严格探索分析，验证该量表具有良好的信效度，可以全面反应护士工作满意度，对于推进护理管理工作的改革及降低离职率具有重要意义。由于条件所限，未进行验证性因子分析，对于维度分布情况有待进一步验证，今后在更多样本、更广范围上进一步验证其信效度，并建立全国常模。

1.2 方法

The plot for the forthcoming analysis is given in Fig. 8.

1.2.1 小鼠饲养管理及分组：36只2周龄幼年雌性ICR小鼠，体重(11.06±0.81)g，均购自宁夏医科大学实验动物中心。本课题获得宁夏医科大学伦理委员会同意。小鼠预饲1周后，随机分为热应激组(18只，每天中午12:00至14:00放置于40 ℃通风正常的动物术后保温箱中)和对照组(18只，室温环境)，保证水和食物充足，其他饲养条件完全相同。分别在6周龄(青春期)、9周龄(性成熟)和12周龄(成年期)每组中随机抽取6只小鼠进行采样。

组织承诺是个人对所属组织的目标和价值观的认同和信任，以及由此带来的积极情感体验。组织承诺的提升，有助于降低员工流失率、缺勤率，有助于员工绩效和组织绩效的提升，更能有效的激发员工的主动性和创新能力。

1.2.4 卵巢组织切片HE染色和卵泡计数：将小鼠卵巢置于4%多聚甲醛中固定24 h，随后进行梯度酒精脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋处理。将包埋好的卵巢组织进行连续矢状切片，切片厚度8 μm，每隔20张取一张切片进行HE染色和卵泡计数。由于原始卵泡数目众多计数不准，本实验只记录初级卵泡、次级卵泡及相应的闭锁卵泡[13]。为了避免重复计数，只记录那些能观察到卵母细胞的细胞核的卵泡。卵泡闭锁率=(闭锁卵泡数目/总卵泡数目)×100%

2.3 热应激对小鼠发情周期的影响：根据小鼠阴道外观及阴道涂片结果显示，确定小鼠的发情周期。结果为热应激组发情周期(5.29±0.19)d，对照组发情周期为(5.5±0.22)d，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2.2 体重、卵巢重及卵巢比重的测量：称量并记录小鼠体重，然后处死，立即取出双侧卵巢，清除周围多余脂肪，使用分析天平称量每只鼠的双侧卵巢重量，卵巢比重=卵巢重(g)/体重(g)。

2.1 热应激对小鼠卵巢发育的影响:由表1可知，与对照组相比，热应激组小鼠在6周龄和9周龄体重、卵巢重及卵巢比重均为差异无统计学意义(P>0.05)。12周龄时，热应激组小鼠体重[(31.43±1.33)g vs(38.02±2.66)g，P<0.05]和卵巢重量[(0.023±0.002)g vs(0.029±0.002)g,P<0.05]显著降低(P>0.05)。

2 结果

表1 热应激对小鼠卵巢发育的影响

2.2 热应激对小鼠卵泡闭锁的影响:通过观察小鼠卵巢切片(图1，目录后)统计小鼠的卵泡数目(表2)，与对照组相比，热应激组小鼠的初级卵泡和次级卵泡的总数及相应闭锁卵泡数目差异不显著(P>0.05)。但9周龄时，热应激组小鼠的次级卵泡闭锁率显著高于对照组[(51.22±4.37)% vs(43.69±5.41)%，P<0.05]，12周龄时，热应激组的次级卵泡闭锁率显著高于对照组[(55.49±3.19)% vs(49.86±3.84)%，P<0.05]。

由于并联机构具有结构紧凑、承载能力强、刚度大、惯性力小、精度高、响应和运动速度快等优点，多为现代多自由度力控末端执行器所用[4]。然而，传统的并联机构构型设计依赖于数学推演和物理机制，难度大且复杂，采用封闭解和数值解等运动学正解的分析方法难以同时得到全部解和实用解，且求解过程复杂、精度低和适应性差；传统设计中，尺度参数多且量纲复杂，优化目标多样，目标函数建模难度大。因此，研究适用于力控末端执行器的新型并联机构构型综合理论与优化技术对设计高精度多自由度力控末端执行器具有重要意义。

表2 热应激对小鼠卵泡闭锁的影响

1.2.3 阴道外观与阴道涂片鉴定小鼠发情周期：从11周龄开始，热应激组和对照组中各取6只小鼠进行标号，每天早晨7：00和晚上19：00进行阴道外观和阴道涂片观察小鼠发情周期。将小鼠翻提，观察外阴，用移液器吸10 μl PBS 滴入阴道口，轻轻抽吸几下，将回收液制成涂片，晾干后进行HE染色，观察阴道脱落的上皮细胞形态。通过以上两种方法共同确定小鼠的发情周期[10-12]，前一次发情期开始到下次发情期的到来为一个发情周期，确保记录一个完整的发情周期。

3 讨论

高温环境下，动物会出现非特异性应激反应，生殖能力和生理状态受到严重影响。在雌性动物体内主要表现为生殖激素分泌不足、卵巢功能障碍、卵母细胞质量下降、发情障碍、受精率下降、胚胎发育不良等，进而导致生育力下降[2-5]。卵巢的发育和功能受到下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO)调控，对温度改变敏感[9]。本试验模拟体外高温环境，研究热应激对幼龄小鼠卵巢发育和生长卵泡数目及其闭锁率的影响。结果显示，12周龄时，相较于对照组，热应激组小鼠体重和卵巢重量显著降低(P<0.05)。

研究表明，雌性奶牛下丘脑通过分泌GnRH，调节垂体释放LH和FSH，从而影响性激素的分泌和卵巢的发育[14]。FSH可以作用于生长卵泡促进卵泡的发育，LH和FSH共同作用于卵泡膜细胞和颗粒细胞促进E2的生成，LH对排卵和黄体生成也发挥着重要作用。而卵巢中卵泡分泌的雌激素(E2)和黄体分泌的孕激素(P4)水平变化，会影响子宫内膜和动物性行为发生周期性变化，从而影响动情周期及生殖活动[15]。Roth Z等研究表明，热应激会影响卵泡的选择，降低卵泡液中E2的浓度，抑制卵泡生长。同时，热应激可以抑制颗粒细胞GnRH的表达并降低生长卵泡中E2的活性，导致卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡[16]。于枫研究发现热应激使小鼠的卵巢和子宫组织发生坏死，且随着热应激强度的增强而加剧[17]。高温会改变雌性奶牛卵巢中的小腔卵泡，最终影响排卵期卵母细胞成熟和发育能力[4]。在本试验中，两组小鼠的初级卵泡、次级卵泡及相应的闭锁卵泡数目差异不显著，但是9周龄和12周龄热应激组小鼠次级卵泡闭锁率却显著高于对照组(P<0.05)，初级卵泡闭锁率的差异不显著。这个结果暗示，热应激可能通过调节下丘脑-垂体-卵巢轴，减少促性腺激素的分泌，影响卵泡生长的环境，减弱卵泡的发育能力，尤其是优势卵泡的发育能力，导致卵泡闭锁率升高。

此外，热应激会降低血液中GnRH和LH的浓度，导致雌性小鼠发情周期延长，影响卵子质量[18]，最终会导致受胎率下降。本实验中，热应激对小鼠发情周期影响不显著，这可能是因为小鼠的个体差异造成的，后期实验可以尝试同发情后观察热应激对小鼠发情周期的影响。

综上可知，热应激可抑制雌性小鼠的体重和卵巢重、提高次级卵泡的闭锁率，推测热应激对雌性小鼠的卵巢发育有一定的抑制作用，但是热应激调节雌性动物卵巢发育的具体机制还有待进一步研究。