右美托咪定下调TGF-β/Smad通路促进炎症诱导软骨细胞自噬及抑制凋亡的研究

于 芝，吴茜萍，焦华杰，汪 婷，徐卉芳

骨关节炎(OA)是最常见的慢性关节疾病，发病率随着年龄的增长而增加[1]。该疾病会影响大多数65岁以上的人，是老年人行动能力受损的主要肌肉骨骼原因[2]。膝骨关节炎(KOA)是骨关节炎最常见的类型[3]。右美托咪定(DEX)是一种快速作用的-2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛等多种功效，目前被临床广泛应用[4-5]，同时DEX兼具有抗炎作用，DEX在KOA的治疗具有潜在应用价值，但目前尚无相关文献报道。为进一步明确右美托咪定在KOA治疗中的价值及其机制，笔者设计了本次研究，旨在为DEX治疗KOA的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本次研究于2019年1-12月在宁夏医科大学完成。人关节软骨细胞购自Scien Cell公司。细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天(C1062S)，蛋白抗体p-Smad3(bs-2225R)购自Bioss公司，蛋白抗体Bcl(12789-1)、Bax(50599-2)、Beclin(11306-1)、TGF-β1(21898-1)、Smad3(25494-1-AP)、P62(18420-1)、LC3(14600-1)以及HRP标记山羊抗兔二抗(SA00001-2)购自Proteintech公司。

1.2 软骨细胞培养：人关节软骨细胞培养条件：37 ℃培养箱，5% CO2；细胞培养液：DMEM培养液+10%FBS+1%双抗，细胞融合达到70%左右进行传代。

1.3 细胞实验分组及处理：取对数生长期人关节软骨细胞分为正常对照组(n=3)、模型组(n=3)、DEX治疗组(n=3)。正常对照组细胞正常培养，不做任何特殊处理；模型细胞加入10 ng/mL脂多糖体外构建关节炎软骨细胞炎症模型[6]；DEX治疗组细胞加入0.01 μmol/L DEX，30 min后加入10 ng/mL脂多糖。

1.4 细胞CCK8增殖检测：3组细胞分别接种于96孔板中，每空104个细胞，每组3个重复，分别于接种后的24、48、72 h加入10% CCK8工作液，37 ℃孵育2 h 后，酶标仪检测450 nm吸光度值，记录数据。

1.5 细胞凋亡检测：0.25%胰酶消化，离心(300 g，5 min)，PBS洗涤收集各组细胞，70%乙醇固定30 min，PBS离心洗涤3次，加入凋亡检测工作液，4 ℃避光反应30 min后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。每组样本重复3次。

1.6 Western-blot凋亡、自噬相关蛋白表达检测：0.25%胰酶消化，300 g离心5 min。PBS洗涤收集各组细胞，裂解液裂解细胞，BAC测定总蛋白浓度，在95 ℃ 加热变性。SDS凝胶电泳、转膜，5%脱脂乳室温封闭1 h，4 ℃一抗[Bcl(1∶3 000)、Bax(1∶5 000)、LC3(1∶2 000)、P62(1∶5 000)、Beclin(1∶3 000)、Smad3(1∶1 000)、TGF-β1(1∶3 000)]孵育过夜。第二日PBST洗膜后，室温二抗(HRP标记山羊抗兔二抗，1∶10 000)孵育1h，ECL曝光检测，实验重复3次。采用ImageJ软件对蛋白表达进行相对定量分析。

2 结果

2.1 3组细胞增殖率检测情况：CCK83组细胞增殖检测，模型组随着时间的增加细胞数量逐渐减少，模型组72 h 细胞OD值较正常对照组明显降低，差异具有统计学意义(t=84.50，P<0.05)，而DEX组72 h 细胞OD值较模型组升高，差异具有统计学意义(t=28.64，P<0.05)，见表1。

表1 3组细胞不同时间增殖率比较(OD值,

2.2 3组细胞凋亡、自噬检测：正常对照组细胞凋亡率为(2.10±0.10)%，模型组为(22.30±0.36)%，DEX组为(12.07±0.38)%，3组间比较差异有统计学意义(F=32.40，P<0.05)。模型组细胞与对照组比较，差异具有统计学意义(t=93.51，P<0.05)；DEX组与对照组比较，差异具有统计学意义(t=44.08，P<0.05)；模型组与DEX组比较，差异具有统计学意义(t=33.90，P<0.05),见图1(封三)。

凋亡相关蛋白表达检测，模型组与正常对照组比较，抗凋亡蛋白Bcl2蛋白表达下调，Bax凋亡蛋白表达上调；DEX组与模型组比较Bcl2表达下调，而BAX蛋白表达上调。

自噬相关蛋白表达检测，模型组与正常对照组比较，LC3-Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表达下调，p62蛋白表达上调；DEX组与模型组比较，LC3-Ⅱ蛋白、Beclin-1蛋白表达上调，p62蛋白表达上调。

2.3 3组细胞TGF-β/Smad通路蛋白表达检测：Western-blot法检测3组细胞TGF-β/Smad通路蛋白表达，结果显示模型组细胞TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达较正常对照组表达上调；DEX组TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白表达较模型组表达下调，见图2(封三)。

3 讨论

骨关节炎是最常见的关节炎，是导致成年患者残疾的主要原因[7]，其中膝关节是受影响最严重的关节。KOA形态学变化以软骨退行性变、破坏,软骨下骨硬化、囊变及滑膜炎症等为主,临床主要表现为膝关节疼痛、关节积液甚至是关节功能受限[8]。相关文献资料显示，外伤、炎症等多种因素导致关节软骨细胞凋亡、功能障碍是KOA发生发展的关键[9]，而TGF-β,IGF以及 Wnt 等信号通路在这一过程中起到了重要作用[10]。

细胞自噬和凋亡分别控制细胞内的细胞器和蛋白质以及有机体内细胞的更替，许多应激途径依次诱导细胞自噬和凋亡。自噬是一个高度保守的真核细胞循环过程，自噬通过细胞质、蛋白质和大分子的降解以及分解产物的回收利用，正常情况下自噬的基础水平保证了衰老和受损细胞器的生理更新，在细胞存活和维持中发挥重要作用，应激条件下自噬的激活是细胞层面的适应性反应，而这一过程的功能障碍导致了许多人类疾病的发生[11]。细胞自噬与细胞凋亡之间的复杂相互作用决定了组织损伤的程度和疾病的进展，一般来说，自噬阻断了细胞凋亡的诱导，而凋亡的激活则阻断了自噬过程。

本研究通过构建软骨细胞炎症模型，发现模型组软骨细胞凋亡率显著增加，而细胞自噬受到抑制。Western-blot法进一步检测发现，模型组TGF-β1、Smad3及p-Smad3蛋白较对照组表达上调，表明模型组TGF-β/Smad通路被激活；而DEX组较模型组比较细胞凋亡率下降，细胞自噬水平增加，TGF-β/Smad通路受到抑制，表明DEX通过抑制软骨细胞TGF-β/Smad信号通路促进细胞自噬而抑制细胞凋亡。

综上所述，DEX通过下调TGF-β/Smad信号通路促进人软骨细胞自噬而抑制炎症诱导的细胞凋亡，表明DEX在延缓KOA发展及治疗方面具有潜在的应用价值。