1,25-(OH)2D3干预糖尿病大鼠模型对P38MAPK与TGF-β1的影响及肾保护作用研究

仇菊萍，刘学燕

肾脏是糖尿病进展后主要累及器官，糖尿病肾病的发生将显著增加患者病死率[1]。因而，早期对糖尿病患者进行肾功能监测，并有针对性地给予保护性干预对阻断病情，改善患者预后具有积极作用[2]。1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3]是维生素D的活化形式，既往已有报道显示1,25-(OH)2D3具有抗炎与免疫调节作用[3-4]，且对肾脏可发挥保护功能，但目前有关其具体机制尚未完全阐明。本研究建立糖尿病大鼠模型，并观察1,25-(OH)2D3对肾组织P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)与转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，以探讨其疗效及其可能的作用机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选用84只清洁级健康大鼠作为实验动物，周龄5～7周；体重(180.54±35.96)g。实验动物均由中国医学科学院医学实验动物实验研究所提供，所有动物均为雄性。

1.2 动物分组与建模：采用随机数字表法将84只大鼠分为A、B、C 3组，每组各28只。A组采用常规饲料喂养，常规饲料均由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，连续喂养6周。B、C组给予高脂高胆固醇饲料喂养6周，饲料配方：67%常规饲料+20%蔗糖+10%炼猪油+2%胆固醇+1%胆盐。经尾静脉采血，检测血糖值，以血糖>16.7 mmol/L提示糖尿病大鼠建模成功[5]。建模成功后A组继续给予常规饲料喂养，B、C组给予高脂高胆固醇饲料喂养，同时B组给予1,25-(OH)2D3腹腔注射，5 μg/kg，隔日注射1次，注射部位选择在下腹腹白线左侧0.5 cm处，共7次。注射完成2周后处死大鼠。

1.3 实验室方法：分别在喂养开始时(T1)、建模成功时(T2)及1,25-(OH)2D3干预完成后2周时(T3)经大鼠尾静脉采血，离心取上清液送检。采用免疫比浊法检测血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)，计算内生肌酐清除率(Ccr)=Ucr/Scr×每分钟尿量。采用Ichem-520型全自动血液生化分析仪(深圳库贝尔生物科技有限公司提供)检测血尿素氮(BUN)和胱抑素C(Cys-C)水平。

在处死大鼠后摘取肾脏，取1.5 mm×1 mm×1 mm标本进行石蜡切片，采用免疫组化染色，以0.3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后滴加一抗，4 ℃过夜，37 ℃孵育1.0 h，PBS冲洗后滴加二抗。一抗为P38MAPK多克隆抗体和TGF-β1多克隆抗体，二抗为山羊抗兔IgG。在显微镜下显色，复染。取高倍镜视野记录阳性细胞数与染色情况。以阳性细胞数与染色评分相加≥2分结果为阳性，2分≤评分≤3分为(+)，3分<评分≤5分为(++)，评分>5分为(+++)。取肾组织1.5 mm×1 mm×1 mm作为实验标本，提取标本总蛋白，采用Western bolt法检测肾组织P38MAPK与TGF-β1蛋白相对表达量，依次进行电泳、转膜处理，以β-actin蛋白作为内参照，以光密度值(OD)目的蛋白与OD β-actin蛋白比值为P38MAPK与TGF-β1相对表达量。

2 结果

2.1 3组大鼠肾功能指标比较：3组大鼠T2和T3时Ccr、BUN及Cys-C水平差异显著，其中T2时B、C 2组Ccr、BUN及Cys-C水平显著高于A组(P<0.05)，T3时B组Ccr、BUN及Cys-C显著低于C组，高于A组(P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠肾功能指标比较

2.2 3组大鼠P38MAPK与TGF-β1比较：3组大鼠肾组织P38MAPK与TGF-β1表达差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图1-图4(封三)。

表2 3组大鼠P38MAPK与TGF-β1比较 [n(%)]

2.3 3组大鼠P38MAPK与TGF-β1蛋白表达：3组大鼠肾组织P38MAPK与TGF-β1蛋白相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)，B组大鼠P38MAPK与TGF-β1显著低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。3组大鼠肾组织P38MAPK与TGF-β1蛋白相对表达量呈正相关性(r=0.418，P<0.05)。

表3 3组大鼠P38MAPK与TGF-β1蛋白表达

3 讨论

1,25-(OH)2D3是具有上调抗菌肽、抑制炎症反应作用的免疫调节剂，既往报道证实1,25-(OH)2D3能调节钙磷代谢[6-7]，这对于改善肾小管重吸收作用，减少钙磷排出具有重要意义。Huhtakangas J A等[8]研究也显示1,25-(OH)2D3可调节大鼠肾脏组织细胞和血管生长因子表达，达到减轻蛋白尿，保护肾功能的目的。Ccr能客观反映肾小球滤过功能，Cys-C是经肾小球滤过的小分子量蛋白，报道还证实Ccr与Cys-C具有良好的相关性，与肾功能损伤程度密切相关[9-10]。本研究设计糖尿病大鼠模型，结果显示1,25-(OH)2D3干预能显著改善糖尿病大鼠Ccr与Cys-C水平，保护肾功能，证实了既往结论。

炎症反应和免疫应激反应是糖尿病肾病发病的关键因素，TGF-β1等炎性因子过度表达，可促进肾脏结缔组织增生和热休克蛋白[11-12]，进而导致肾间质纤维化发生发展。Zhang L等[13]还认为TGF-β1活化在糖尿病累及肾脏过程中发挥着核心作用。而P38MAPK是MAPK家族重要成员，既往研究认为P38MAPK参与细胞分化、增殖及凋亡过程[14]，曹少祥等[15]发现P38MAPK可诱导bcl-2和caspase-3介导的细胞凋亡。郑妩媚等[16]研究则显示P38MAPK可调控NF-kB等核转录因子，参与炎症反应。本研究发现1，25-(OH)2D3干预后B组P38MAPK与TGF-β1显著低于C组，提示1，25-(OH)2D3能调节P38MAPK与TGF-β1水平，且P38MAPK与TGF-β1具有相关性，提示P38MAPK可作为TGF-β1下游信号通路,促进糖尿病肾病病理进展。而1,25-(OH)2D3干预可能通过抑制TGF-β1表达，进而调控P38MAPK介导的炎性反应，减轻肾损伤。另外，P38MAPK可作为TGF-β1上游信号通路[17-18]，二者相互影响，在1,25-(OH)2D3干预后抑制TGF-β1与P38MAPK信号通路，这可能是其发挥保护肾功能作用机制之一。