多发性骨髓瘤相关生物标志物的研究进展

赵建治，糜坚青

（1.浙江省绍兴市中心医院血液科，浙江 绍兴 312030；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科，上海 200025）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是血液科常见的第二大肿瘤，中国的MM 患病率为5.68/10 万人，每年发病率为1.16/10 万人[1]。MM 新型治疗药物，如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米、卡非佐米、依沙佐米）、免疫调节剂（沙利度胺、来那度胺、泊马度胺）、单克隆抗体和嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法等已被应用于临床，MM 患者的中位生存时间几乎延长了3 倍[2-3]。然而MM 仍被认为是不可以治愈的，多数MM 患者最终会复发并死于疾病进展，因此仍需要进一步探索早期诊断、评估MM 的新方法。

广义的生物标志物包括血常规、生化、影像学、免疫学、遗传学、二代测序等检测结果以及其综合评分系统。生物标志物检测是诊断和监测MM 疾病进程的重要手段之一，对生物标志物的研究也在不断推进着MM 新诊治策略的发展。早期应用的MM 生物标志物如Durie-Salmon 分级系统，其主要指标包括M 蛋白、血红蛋白、血钙、肌酐以及骨骼损害等，在测定肿瘤负荷和患者危险分层中起一定作用，但该分级系统并没有考虑遗传学和疾病临床变异对预后产生的影响。

近年，MM 相关生物标志物研究进展较快。本文分析目前已经在使用的MM 诊断、疗效检测指标，包括国际分级系统（international staging system,ISS）标准、影像学特征、免疫球蛋白游离轻链及重链的检测和细胞遗传学分析，总结新近研究发现有前景的MM 新生物标志物，如流式细胞、第二代测序、循环肿瘤细胞、肿瘤DNA 等方法检测的生物标志物及其预后评估作用，具体报道如下。

目前已在临床广泛使用的MM 预后评估监测指标

目前临床已经使用的监测预后评估指标包括预后分级系统、影像学参数，和免疫球蛋白游离轻链、重链分析等。

一、预后分级系统

1.国际分期系统 （international staging system,ISS）:ISS是一种基于血清白蛋白和β2微球蛋白（β2microglobulin，β2-MG）这2 个参数的简单危险分层系统，根据ISS Ⅰ～Ⅲ级可将MM 患者的预后情况分为3 种。但ISS 分级对MM 患者预后判断的精确度依赖于白蛋白和β2-MG 水平，而这两者会受到肾功能异常及其他合并症的影响，且ISS 缺乏疾病生物学指标检测，故有所局限。修订的ISS（revised ISS，R-ISS）分级（见表1）则结合了血清乳酸脱氢酶和染色体异常，故其对评估MM 预后价值有所提高。有研究对MM 患者进行中位时间为46 个月的随访显示，R-ISS Ⅰ级患者的5 年总体生存（overall survival，OS）率为82%，R-ISS Ⅱ级患者的OS 率则为62%，R-ISS Ⅲ级患者的OS 率为40%；而R-ISS Ⅰ～Ⅲ级患者的5 年的无进展生存 （progress free survival,PFS）率分别为55%、36%和24%[4]。

表1 ISS 和R-ISS 相关指标比较

2.治疗反应相关分级因素的预后:目前所有的MM 预后分级系统均采用患者接受治疗前存在的因素来进行危险预测，然而现在学者们已逐渐认识到MM 治疗后反应也是一种重要的生存预后指标。最近的几项研究显示，自体干细胞移植后早期复发对于患者的生存预测价值比ISS 及细胞遗传学更高[5]。相信未来一定会逐步建立起一个兼顾肿瘤生物学及其他相关因素的风险分层系统。

二、影像学表现

目前有多种影像学技术可以来检测MM 的骨破坏，如代谢性骨扫描、全身低剂量CT、MRI、PET-CT 等检查。CT 扫描是一种检测早期骨破坏的理想工具，但其并不能观察到早期破坏区域的骨髓瘤活性病灶。MRI 和PET-CT 的影像学特征最近已被纳入MM 诊断和预后评估的新标准中，MRI和PET-CT 对早期局灶性病变的检出效果相同，且均具有80%的高检出率，但MRI 在对弥漫病变的检测中更具优势。最近发表的前瞻性研究对MM 患者进行了随访后显示，MRI检查缺乏评估患者预后的有效性，而PET-CT 检查能够更好地评估患者的预后[6]。然而，PET-CT 检查也具有一定的局限性，如结果判定缺乏标准化，且由于11%的人群缺乏己糖激酶2 的表达，这可能导致部分患者的PET-CT 检查出现假阴 性结果[7]。可见，MRI 和PET-CT 检查可以互补。这2 个检查结果全阴性可能是未来评估MM 疗效的目标，双阴性提示治疗后患者可获得较好的影像学缓解，2 种方法互相补充，可提高灵敏度和特异度。最新的PET-MRI 检查可能是今后这个评估领域里新的方向之一。

三、免疫球蛋白游离轻链（free light chains，FLC）和重链分析

FLC 升高和游离轻链比值 （ratio of FLC，rFLC） 异常在MM 患者中较常见，且具有一定的预后评估价值。目前已经证明，异常的rFLC 比值（累及/未累及的rFLC＞100）是一种能准确预测MM 患者生存和治疗反应的标志物，在近年更新的国际诊治标准中其已作为一项新的治疗评估指标被提出。该指标对MM 患者预后的影响独立于高危染色体易位[如t （4:14） 和t （14:16）][8]。李璐等[9]发现，对于初治MM 患者，rFLC≤14.828 或受累与未受累FLC 的差值≤112.85 mg/L时，具有更低的死亡风险，危险比也更低，在此临界值以下的患者预后较为理想。

四、遗传学标志物

1.遗传学异常:MM 的发病机制涉及14 号染色体免疫球蛋白重链的易位，包括奇数染色体的超二倍体拷贝数变化和染色体臂获得或缺失[10]。超二倍体和染色体易位是MM患者中最常见的遗传学异常，许多研究报道，细胞间期原位杂交荧光 （interphase fluorescence in situ hybridization，iFISH） 染色和细胞遗传学特征在MM 患者中具有一定的预后判断意义，其中t（14:16）、t（14:20）及17p 缺失与患者预后不良相关，t（11:14）、t（6:14）及三倍体与患者的低危风险相关（见表2）[11]。新诊断的MM 患者中，约有40%存在1q 扩增，且无论其是否接受免疫调节剂强化疗，1q 扩增都与其不良预后相关。另有约32%的新诊断MM 患者有1p 缺失，这亦与较差的生存相关。

表2 细胞遗传学异常的预后价值

其他一些遗传学异常对治疗后MM 患者的预后也具有特异性的评估价值。如以往研究显示，t（4:14）与MM 患者较差的预后相关，但在使用了蛋白酶体抑制剂治疗后，存在这种易位患者的生存率已有了显著提高[12]。激活癌基因MYC的易位被认为是伴随疾病进展的继发性事件，在15%的MM患者中可见这种易位，并可导致较低的PFS 率和OS 率[13]。为了更好地对MM 患者进行预后分层，已将存在高危iFISH结果[t（4:14）、t （14:16）和17p 缺失]者整合到ISS 和乳酸脱氢酶中，形成R-ISS。到目前为止，没有任何单个基因遗传改变可以单独诊断高危MM，因此需要确定一组细胞遗传学异常指标以识别预后不良的患者。

2.基因表达谱 （gene expression profiling，GEP）:GEP 是一种将多种基因异常和通路的影响结合，形成单个特征的方法。阿肯色医科大学（University of Arkansas Medical Sciences，UAMS）开发了第一个GEP 模型，包含了70 种基因谱，其中30%位于1 号染色体（1p 和1q）[14]。UAMS GEP 70 测定的预后价值已在多个独立研究中被证实，包括UAMS 识别的17 个基因特征、IFM 试验中的15 个基因特征以及MRC骨髓瘤Ⅸ试验中的6 个基因特征等，均已经明确与MM 患者较短的生存期相关[15]。2019 年梅奥发布的MM 诊治指南中采用荧光原位杂交、GEP 和浆细胞标记指数建立的mSMART 3.0 危险分层（见表3），并提出了双打击和三打击的概念。但由于很多医院并不能够检测GEP、PCLI，所以这2个项目在临床中并不常规推荐使用。GEP 是MM 风险评估的一种潜在方法，但为了适应广泛使用，需要确定一种标准化的、更方便的GEP 特征检测方法。

表3 mSMART 3.0 的危险分层

新近研究的预后指标及检测方法

新近研究证实，有应用价值的新MM 预后评估生物标志物包括微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）及循环肿瘤细胞 （circulating tumor cell，CTC） 或循环肿瘤DNA（circulating DNA，ctDNA）检测等。

一、MRD

1.MRD 检测价值:MRD 正在成为MM 的一种重要生物标志物。传统上临床常用测定M 蛋白来评估MRD，近年来随着检测MRD 技术的进步，如多参数流式细胞术（multiparameter flowcytometry，MFC）、实时定量PCR、二代测序等，使MRD 检测在MM 预后评估中具有重要参考价值。虽然目前MM 治疗已取得了显著的发展，但仍有相当一部分患者对治疗的反应起先较好，随后又出现复发，提示其可能存在着一些MRD 传统标志物检测不到的MRD。综合分析前瞻性研究后发现，无论采用什么治疗方案或患者的危险分层如何，MRD 在PFS 期和OS 期中的预测价值都超过了完全缓解的预测价值[16]。已发表的荟萃分析支持了这个观点，表明任何治疗后MRD 阴性都与更好的预后相关，MRD 阴性状态与PFS 时间显著改善相关。在常规完全缓解的MM 患者中，MRD 阳性则预示着更短的PFS 期。

2.MRD 检测方法相关的预后评估:测定MRD 的新技术如流式细胞术和第二代测序技术，已经成为监测MM 患者治疗反应的重要方法[17]。因此，国际骨髓瘤工作组新的共识标准重新定义了疾病反应，特别强调了MRD 的定义和评估方法。美国国立综合癌症网络已经将MRD 纳入MM 的治疗反应标准中[18]，相信未来会有更多的临床医师将MRD 作为临床试验中一种危险分层工具。

（1）采用MFC 检测MRD 评估疗效:MM 患者治疗后缓解状态的评估对于预测疾病过程非常重要。在自体干细胞移植（autologous stem cell transplantation,ASCT）后100 d 使用MFC 检测MRD，MRD 阴性患者的PFS 期、OS 期较MRD阳性患者长[19]。多因素分析发现，在ASCT 后100 d，用MFC检测MRD 是PFS 期和OS 期的重要预测因子。MRD 检测结果在具有较差或较好细胞遗传学表型的患者中都会表现出这种预测作用。使用欧洲第二代流式细胞术能够更加灵敏地检测MRD（检测下限为10-5，传统方法的检测下限为10-4），这种方法更加可靠，并可以广泛使用[20]。

（2）采用等位基因特异寡核苷酸实时定量PCR（allelespecific oligonucleotide quantitative real-time PCR，ASO-qPCR）检测评估MM 疗效:ASO-qPCR 是检测MRD 的另一种方法，其可检测克隆性MM 浆细胞特异的免疫球蛋白重链基因重排，以此来识别低水平的MM 浆细胞。有研究采用ASOqPCR 检测了处于缓解期和进展期的MM 患者，结果发现，进展期患者的骨髓和外周血肿瘤细胞水平较缓解期患者显著升高。Puig 等[21]比较了获得部分缓解的170 例临床试验患者采用ASO-qPCR 与MFC 检测得到的MRD 结果，发现这2 项技术在MRD 定量检测结果中有显著相关性 （r=0.881，P＜0.001）。低MRD 患者有更长的PFS 期和OS 期，ASO-qPCR与MFC 的检测结果相似。然而，由于缺乏克隆的有效检测、测序不成功、ASO 性能不稳定等原因，所以ASO-qPCR 只能在42%病例中使用。

（3） 采用第二代测序技术检测MRD 对疾病预后的评估:另一种测定MM 患者中MRD 的方法是第二代测序技术。Martinez-Lopez 等[22]使用深度测序评估了133 例MM 患者治疗后MRD 测定的预后价值，结果发现第二代测序技术测定MRD 阴性患者的PFS 期 （80 个月比31 个月）、OS 期（没有达到终点比81 个月）较阳性患者显著延长。

目前的基因测序研究已明确了MM 的异质性突变谱，其中较常见的突变基因是KRAS 和NRAS（分别占20%），其他常见突变基因还有TP53、DIS3、FAM46C 和BRAF，大约有10%的患者可同时出现这些突变。测序研究证实，MM 患者最显著的特征是随着时间延长会检测到不同类型MM 的亚克隆存在，这更加提示了该疾病具有异质性，并提出MM 靶向治疗需要不断更新发展的问题[23]。

二、CTC

血液活检是指使用外周血测定CTC 或ctDNA，这是一种可用于疾病检测的很有前途的微创新技术。骨髓穿刺活检是传统的诊断和监测MM 的方法，但由于骨髓瘤在骨髓中的浸润常呈局灶性表现，因此骨髓穿刺活检有其局限性，而血液活检更容易被患者所接受，且不会受MM 病变局灶性的影响，能更好地检测到MM 异质性的克隆，因此有望成为一种有优势的技术。多项研究表明，血液活检与骨髓穿刺的标准方法比，不仅可准确检测到不同肿瘤的突变谱，且可以作为预测疾病复发及预后或评估治疗反应的生物标志物[24]。针对该领域，目前正在进行更深入的研究，已获得的数据显示出其具有巨大的应用潜力。

1.冒烟型MM:有研究分析了91 例冒烟型MM 患者后发现，循环浆细胞＞5 000×106个/L 的患者2 年中进展为活动性疾病的概率比对照组患者（浆细胞＜5 000×106/L）高（71%比25%），前者的中位数进展时间为12 个月，后者为57 个月，并且该进展风险独立于M 蛋白水平，与循环浆细胞低水平的患者相比,这些具有高水平循环浆细胞的患者有更短的OS 期（49 个月比148 个月）[25]。

2.新诊断的活动性MM:在新诊断的活动性MM 患者中，CTC 检测有望能预测其病程和疾病严重程度。在新诊断的活动性MM 患者中，73%的患者可以检测到循环浆细胞，循环浆细胞数量与较短的OS 期相关。在多因素分析中，循环浆细胞的预测值独立于β2-MG、白蛋白和年龄。有研究分析了新诊断的MM 患者，检测每15 000 个有核细胞中发现循环浆细胞≥400 个与浆细胞高增殖及不良细胞遗传[t（4;14）、t（14;16）、t（14;20）、Del 17p]相关[26]。

循环浆细胞的分化级别也是预测新诊断MM 患者临床结局的因子。一项纳入了225 例不适合移植的新诊断老年MM 患者的前瞻性研究发现，其中59%的患者存在全分化克隆（CD19-CD81-），38%存在中等分化的克隆（CD19-CD81+），3%存在低分化克隆（CD19+CD81+）[27]。与高分化患者相比，处于低分化和中等分化阶段患者的PFS 期、OS 期较短，因此浆细胞分化情况被认为是PFS 期和OS 期的独立预后因子。

3.难治复发的MM:CTC 在难治复发MM 患者治疗效果预测中显示出一定价值。一项研究分析了经治疗的MM 患者，发现活动性复发MM 患者似乎比稳定期患者更易检测出克隆性循环浆细胞，而达到完全缓解的患者均未检测到循环浆细胞。在稳定期MM 患者中，出现循环浆细胞预示着其具有更短的中位生存时间（22 个月比未达到终点），且在活动期复发的MM 患者中，循环浆细胞≥100 个时预示着其生存时间更短（12 个月比33 个月）[28]。

多项研究发现CTC 与骨髓浆细胞间有相似的基因特征。Kis 等[29]检测了53 例MM 患者共64 个ctDNA 样本中KRAS、NRAS、BRAF、EGFR 和PIK3CA 基因的所有外显子，发现该方法能够准确预测匹配的骨髓衍生肿瘤DNA 样本中96%的突变，其检测特异度＞98%。另有研究在MM 患者的ctDNA 标本中检测到了128 个突变，而在正常对照组中没有检测到相关突变，其中24.2%的基因突变仅在或主要在血浆中检测到，且疾病复发患者中突变的数量显著高于新诊断的MM 患者[30]。已有研究证实，CTC 和ctDNA 检测在不同危险分层、疾病活性及难治复发性MM 的生存预后预测中发挥了重要作用。

结 论

虽然不少研究在MM 治疗方面有了很大进展，但仍然存在相当数量的复发或者难治患者，这揭示了MM 采用单药治疗，或抑制单个靶点、单个路径治疗的效果尚不理想。传统生物标志物的检测对于估计肿瘤负荷和预测疾病进程有效，但其均没有考虑MM 患者的克隆异质性。新近生物标志物检测方法，包括流式细胞术、第二代测序技术和CTC 检测，提供了能更好地评估预后和监测治疗反应的新途径。同时，寻找兼顾MM 异质性和MRD 标准化的生物标志物，是今后的研究方向，驱动治疗的生物标志物也是目前研究的一个重要目标。未来，在新生物标志物指导下的多靶向治疗和危险分层治疗将会取代传统的治疗方法，从而使MM 患者的疾病获得长期控制，甚至治愈。