多重耐药铜绿假单胞菌耐药基因分析与抗菌中药筛选

杨雪琼，陈锡娇，高玉芳，周熠炯，张玺威，陈剑涛，陈 鑫

（佛山科学技术学院口腔医学院，广东 佛山 528000）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA）是我国院内感染常见的条件致病菌之一，近年来在院内感染中的检出率不断上升[1]，全国细菌耐药监测网（CARSS）最新数据显示，铜绿假单胞菌的临床分离率位居第3，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。随着抗菌药物的广泛使用特别是滥用，铜绿假单胞菌的耐药问题日趋严重，耐药菌株不断出现而且多呈多重耐药性，而多重耐药铜绿假单胞菌（Multidrug-resistant Pseudomonas Aeruginosa，MDRPA）常与全球流行病暴发有关，可导致很高的发病率和死亡率[2]，给临床治疗MDRPA感染带来了巨大挑战。因此，本研究对从佛山市某大型三甲综合医院收集后筛选得到的MDRPA菌株进行耐药特性分析，以期为临床治疗MDRPA感染提供用药参考依据。

此外，大量研究报道中药在治疗细菌感染方面有其独特的作用，且具有不易产生耐药、毒副作用小、资源丰富等优势[3]；另外临床抗感染经验表明，单一用药对铜绿假单胞菌的治疗并不理想，容易产生耐药，许多权威机构主张联合用药。因此，本研究在研究耐药机制的同时，从20种清热解毒中药中筛选对MDRPA具有体外抗菌活性的中药并进行联合用药研究，以获得最佳的中药联用组合，为中药的进一步开发利用提供参考的同时为临床治疗MDRPA感染提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 菌株

从佛山市某大型三甲综合医院的临床检验科收集50株临床分离的铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌（ATCC27853）为质控菌株（购于国家卫生健康委员会临检中心）。

1.2 药物与试剂

黄连、半枝莲、金银花、射干、大叶青、赤芍、蒲公英、白花蛇舌草、板蓝根、鱼腥草、决明子、知母、黄芩、夏枯草、栀子、牡丹皮、芦根、生地黄、石膏、菊花（购于青岛医保城医药公司）；营养肉汤（NB）培养基、MH肉汤培养基、琼脂粉（购于青岛海博生物）；氨基糖苷修饰酶、碳青霉烯酶等引物，DNA染色剂、琼脂糖、Premix Taq（购于上海生工生物工程技术服务有限公司）；抗生素药敏纸片（购于杭州微生物试剂有限公司）。

1.3 主要仪器

智能恒温培养箱、超低温冰箱、高压蒸汽灭菌锅（购于广州科晓科学仪器有限公司）；超净工作台（购于广州沃霖实验室设备有限公司）；PCR仪（购于美国Bio-Rad公司）；电泳仪（购于六一生物科技有限公司）；凝胶紫外成像分析仪（购于上海嘉鹏科技有限公司）；微量移液器和多道移液器（购于梅特勒—托利多国际有限公司）；酶标仪、微型离心管（EP管）、96孔聚苯乙烯板、一次性培养皿等（购于广州步前生物科技有限公司）；Eppendorf离心机（购于艾本德中国有限公司）。

1.4 铜绿假单胞菌药敏试验

采用药敏纸片法（K-B法）对临床分离的50株铜绿假单胞菌进行初筛。操作如下：（1）菌液准备：将收集来自-80℃冰箱的铜绿假单胞菌菌株取出，在营养肉汤培养基平板进行复苏，连续传两代（细菌状态稳定）后取对数生长期的细菌菌落2～4个（约1 mm）混于2～3 mL MH肉汤培养基中，配成0.5麦氏浊度的菌悬液；（2）接种及贴药：取350 μl上述菌悬液均匀涂布于MH肉汤培养基平板，15 min内间隔一定距离贴上抗生素药敏纸片；（3）培养：37℃温箱培养 16～18 h；（4）结果判定：读取并记录培养后MH平板上抗生素药敏纸片周围的抑菌圈，对照CLSI标准得出相应抗生素对菌株的抑菌效果，从而筛选出MDRPA[4]。

1.5 耐药机制研究——耐药基因检测

（1）聚合酶链反应：①制备模板：取4～6个菌落（约1 mm）于 100 μl双蒸水（ddH2O）中，100℃煮沸 10 min，再以 14 000 rpm离心5 min，上清液即可作为模板。

②引物处理：氨基糖苷修饰酶基因[包括rmtB、an（t2”）-I、armA、aac（3）-Ib、rmtA、aac（6”）-II）、金属 β- 内酰胺酶基因（包括 blaIMP、blaVIM、blaSPM、blaSIM、blaGIM]、苯唑西林酶（blaOXA-2、blaOXA-10）引物是通过指导教师协助查阅NCBI网站基因序列而设计的，并委托上海生工生物工程有限公司合成。合成后的引物按照说明加相应的无菌ddH2O，配成100 μm的引物，稀释 10 倍（取 10 μl加到 90 μl无菌 ddH2O中），配成浓度为10 μm 的引物。

③PCR反应：反应体系如下（总体系10 μl）：每反应体系含Taq 酶 5 μl、引物 F 和 R 各 0.5 μl、模板 0.8 μl和 ddH2O 3.2 μl。加样完成后进行94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环30个周期；最后72℃延长至5 min。

（2）琼脂糖凝胶电泳[5]：①制胶：本实验配1.5%的琼脂糖电泳胶，称取1.5 g琼脂粉溶于100 mL TAE液（Tris-乙酸-EDTA）中，100℃加热2 min溶解，根据说明书加入相应的DNA染色剂，将未凝固的胶倒在制胶板上，待其凝固后垂直拔起梳子。

②加样：将扩增的产物加到琼脂糖凝胶中，凝胶加样处靠近负极（黑色电极），第1个加样孔加marker做对照，选用100bp的marker。

③电泳：接通电源，120 V电泳30 min左右，将电泳后的凝胶置于凝胶紫外成像分析仪观察是否出现与目的基因大小一致的扩增条带，若有则表明细菌能产生对应的钝化酶。

1.6 中药提取物的制备

采用煮沸法制备中药提取物。取各种中药15 g分别浸泡于250 mL超纯水1 h；用砂锅细火煮2 h，趁热过滤、收集滤液；在残渣中加入150 mL超纯水，再煮2 h，将两次过滤后的滤液混合，加热浓缩至15 mL，即可得到浓度为1 000 mg/mL的中药提取物。将制备好的药液装入瓶中加盖，用高压蒸汽灭菌锅高压灭菌（121℃，15 min），待冷却后放于 4℃冰箱保存备用[6]。

1.7 微量肉汤稀释法

微量肉汤稀释法可测出中药对多重耐药铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC），从而筛选出抗菌效果较好的中药以及有代表性的菌株进行联合药敏试验。

在超净工作台中，取无菌96孔板，先做好标记，在第1排的第1个孔加入用MH液体培养基稀释到100 mg/mL的中药药液200 μl，第2～11排每孔依次加入100 μl MH液体培养基，第12排加入200 μl。再用多道移液器从第1列中取100 μl中药药液至第2排孔，混匀，依此类推至第10排，弃去100 μl，以达到中药药液的倍比稀释，从第1—11排每孔依次加入0.5麦氏单位用MH液体培养基稀释1 000倍的菌液100 μl，最后将96孔板密封置于37℃恒温培养箱中孵育16～20 h。观察结果：在阳性对照有细菌生长且阴性对照无细菌生长的前提下，小孔内澄清无细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度，但若细菌生长在不连续孔时，则该实验可能是药物混匀不当，应重复试验[7]。

1.8 棋盘法联合药敏试验

根据微量肉汤稀释法的结果，发现半枝莲、夏枯草、黄芩、黄连这4种中药对12株菌的抑制效果较为明显并得出相应的MIC。采用棋盘法检测中药的联合作用，使用8个稀释倍数，用中药单用时MIC的4倍浓度作为药物最高浓度，而后用MH培养基依次倍比稀释，分别为 4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 倍MIC。倍比稀释均在96孔板中操作，第9、10列孔分别加入A、B各不同梯度浓度的提取物作为参考，每孔各100 μl，第11列孔不加药作为阳性对照，第12列孔不加药不加菌作为阴性对照（加MH培养基）。然后在第1—11孔各加配好的实验菌悬液100 μ（l接种菌量为1×105CFU/mL），加完后用酶标仪测吸光值（OD），最后置于37℃培养箱中孵育 18～24 h，培养完后再测OD值，观察培养前后吸光度变化，得出中药联用后的MIC并计算其部分抑菌浓度指数（FIC=A药联用时MIC/A药单用时MIC+B药联用时MIC/B药单用时MIC）。FIC≤0.5为协同作用，0.5＜FIC＜1为部分协同作用，FIC=1为相加作用，1＜FIC≤2为无关作用，FIC＞2为拮抗作用[8]。

2 结果

2.1 药敏纸片法结果

采用K-B法对50株铜绿假单胞菌进行初筛得到20株MDRPA，根据CLSL标准得到20株MDRPA的耐药情况。这些菌株对青霉素G、红霉素、头孢唑啉、氨苄西林的耐药率达到了100%，对诺氟沙星的耐药率最低（8%），对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星的耐药率见图1。

图1 20株MDRPA对抗菌药物的耐药情况

2.2 耐药基因检测结果

ant（2"）-I和bla SIM的检出率最高，分别为100%、87%，aac（3）-Ib、aac（6”）-II、blaIMP、blaVIM、blaGIM基因未检出，具体结果见图2。

图2 MDRPA常见的耐药基因及检出率

2.3 微量肉汤稀释法结果

通过微量肉汤稀释法得到的20种中药中，黄芩（MIC：1.56～6.25 g/L）、半枝莲（MIC：3.13～6.25 g/L）、夏枯草（MIC：3.13～25.00 g/L）、黄连（MIC：6.25～25.00 g/L）对 20 株 MDRPA中的12株的抑菌效果较好，选择它们进行棋盘法联合药敏试验。

2.4 棋盘法联合药敏试验结果

通过微量肉汤稀释法可得出中药在单用和联用时对细菌的最小抑菌浓度，结果见表1～3。从各中药组合的棋盘法结果来看，黄芩+半枝莲组合（具有协同作用比例为75%，部分协同作用比例为25%）与黄芩+夏枯草组合（具有协同作用比例为58%，部分协同作用比例为42%）对MRDPA的抑菌效果最好。

表1 棋盘法黄芩与半枝莲联用时的MIC（g/L）

表2 棋盘法黄芩与夏枯草联用时的MIC（g/L）

表3 两种效果较好的中药组合的部分抑菌浓度（%）

3 讨论

3.1 部分耐药基因可编码产生钝化酶引起PA耐药

随着抗生素的广泛应用，PA耐药发展迅速，对常见的抗菌剂的耐药率不断上升，耐药菌株日益增加[9]。此外，铜绿假单胞菌严重感染者病死率高，临床上治疗普遍比较棘手。解决这个难题的关键在于找出细菌的耐药机制，为临床合理用药提供依据。常见的细菌耐药机制包括钝化酶的产生、药物作用靶点改变、主动外排机制、细菌生物被膜作用等。本研究在研究细菌耐药机制中选取了相对重要的机制——钝化酶的产生，大量研究发现，钝化酶可以水解或修饰抗生素结构而引起抗生素失活。（1）细菌对氨基糖苷类抗生素耐药取决于氨基糖苷修饰酶，氨基糖苷修饰酶主要有N－乙酰转移酶（AAC）、O-核苷转移酶（ANT）等，其通过共价修饰的方法使氨基糖苷类抗生素对细菌的作用效果减弱，从而导致耐药[10]。本实验中ant（2”）-I耐药基因检出率最高，推断出细菌可能产生氨基糖苷修饰酶使庆大霉素和阿米卡星降解。（2）检出率居其次的为bla SIM、bla SPM，有研究报道，该酶基因位于染色体或质粒上，可通过转座子、整合子等移动元件进行传播，一旦有MBL耐药基因存在，很容易进行水平传播，进而导致临床中该类菌的耐药率不断升高[11]。（3）有研究表明，苯唑西林酶可能是因为氨甲酰化β-内酰胺类抗生素的活性位点Lys-70残基，从而产生耐药[12]。

3.2 中药联合对MDRPA有抑菌活性

有研究显示，中药在治疗细菌感染方面有较好的效果。结合中药的诸多优势，本研究小组经实验发现黄芩+半枝莲、黄芩+夏枯草这两个中药联用组合抑菌活性较好，由此推断出黄芩在与半枝莲或夏枯草混用时可能发生某些生化机制使得药物更好地发挥其抑菌作用，但本研究尚未深入了解，只可为后续研究提供基础。

综上，在抗菌药物耐药日益严重的形势下，研究细菌的耐药机制的基因水平和开发新型治疗方案极为重要，可为临床合理使用抗菌药物以及控制细菌耐药性的产生、变迁和传播提供理论依据。我国中药资源丰富，且目前中药不易导致细菌耐药，因此未来与中药相关的研究可能会越来越多。而本研究关于中药联用的抑菌活性，可为后续研究提供实验依据并为临床用药提供参考。