氮网球花定碱盐酸盐对活化T细胞增殖的抑制作用

邓弘仙，吴利红，张云惠，范诗逸，黄 玲，蒋海静，赖 翼，杨淑霞，刘 阳，罗兴燕

（成都医学院1.药学院，2.临床医学院，3.检验医学院，4.科研实验中心，四川 成都610500）

T 细胞增殖分化是免疫应答的中心环节，其异常增殖分化在移植排斥反应［1］、类风湿性关节炎［2］和系统性红斑狼疮［3］等自身免疫性疾病的发展过程中扮演着非常重要的角色。而抑制T细胞增殖分化与发挥生物学功能的免疫抑制剂改变了上述疾病的临床治疗效果，使越来越多患者的病情得到缓解。目前，临床上已有一些免疫抑制剂可用于治疗移植物排斥和自身免疫疾病，它们通过不同机制抑制T 细胞的异常活化和增殖，如环孢菌素A 和他克莫司抑制钙调神经磷酸酶活性［4］，西罗莫司（siroli⁃mus）抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路［5］。但自身免疫性疾病是一类多因素诱发、多种细胞参与并涉及多条信号转导通路的复杂疾病。且不同患者的诱发因素、发病机制以及对药物的敏感性，存在显著个体差异。临床治疗过程中发现单一疗法效果不明显时，还需给予联合、轮换或序贯治疗。因此，继续探索疾病的发病机制，发现更多的治疗靶点和全新结构的先导化合物，将为患者带来更多的选择与希望。

文献报道，来源于石蒜科（Amaryllidaceae）网球花葱莲〔Zephyranthes candida（Lindl.）Herb.〕的网球花定碱具有十分广泛的药理活性，如抗疟疾［6］、抗癌［7］、抗病毒［8］以及抗有丝分裂［9］等，但其免疫抑制活性研究尚未见报道。本课题组已建立了免疫抑制活性高通量筛选技术平台，已筛选到一系列具有良好免疫抑制活性的小分子化合物，如BD750［10］和PO-291［11］等。本研究观察本课题组近期筛选到的氮网球花定碱盐酸盐（N-methyl⁃hemeanthidine hydrochloride，NMHC）对活化T 细胞增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 药物、主要试剂和仪器

NMHC、LY294002（磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）和西罗莫司（纯度99%），美国Sigma-Aldrich 公司；RPMI 1640培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（批号：50615），澳大利亚Bovogen 公司；抗人CD3/CD28、抗人CD3-APC、抗人CD25-PE-cy单抗及抗人细胞因子白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）（批号：0416AFC12 I1317）、IL-6（批号：0409AFC16 K1915）、IL-17A（批号：1109AFC84 H2013）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）单抗（批号：0215AFC27-J2615），美国eBioscience 公司；羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）（批号：B258747），美国Invitrogen 公司；人外周血淋巴细胞分离液（批号：71769262），挪威AxisShieldPoC 公司；人T 细胞MACS 磁珠分离试剂盒（批号：5170711130），德国Miltenyl Biotec 公司；细胞凋亡检测试剂盒（批号：20190302）和细胞周期检测试剂盒（批号：20181108），南京凯基生物公司。Ⅱ级A2型生物安全柜、Sorvall Lengend Micro17 型小型台式离心机和3111 型5%CO2培养箱（美国Thermo 公司），AE2000LED 型倒置相差显微镜（日本Olympus 公司），PowerWave XS2 酶联免疫检测仪（美国Bio-Tek公司），Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2 人外周血单个核细胞分离和T细胞纯化

经捐赠者知情同意，静脉采集其外周血。采用密度梯度离心法［12］分离外周血单个核细胞（periph⁃eral blood mononuclear cells，PBMC），分离步骤为：①将采集的人外周血与FBS 等比例混合后，倾斜45 度贴壁缓慢加入到已经预先加入淋巴细胞分离液的10 mL 玻璃离心管中，外周血、PBS 和人外周血淋巴细胞分离液三者的比例为1∶1∶1，室温下600×g 离心，20 min。②离心后吸出并收集中间的乳白色单个核细胞层，用1% FBS-RPMI 1640 不完全培养基重悬离心300×g，5 min，重复2 次。③离心后的细胞用10% FBS-RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，得到人PBMC。

分离后的PBMC，按照人T 细胞分选试剂盒说明书阴性分选人T细胞［13］。纯化步骤为：①用2 mL离心管取分离出的人PBMC，300×g 离心10 min，去上清。②每1×107个细胞使用40 μL试剂盒提供的缓冲液重悬细胞，然后加入10 μL 生物素标记的混合抗体。混匀后2～8℃静置孵育10 min。③孵育结束后，加入1 mL 缓冲液洗涤后，300×g 离心10 min，去上清。④每1×107个细胞使用30 μL 缓冲液重悬细胞，然后加入20 μL 抗生物素微球。混匀后2～8℃静置孵育15 min。⑤加入1 mL 缓冲液洗涤后，300×g 离心10 min，去上清。使用200 μL缓冲液重悬细胞，备用。⑥将MS 柱安装在标准磁力架上，使用500 μL 缓冲液润洗1 次。将备用的200 μL 细胞加入MS 柱，让细胞自然流出，用2 mL离心管收集细胞。⑦使用缓冲液洗涤MS 柱每次400 μL，3 次，使用同一管2 mL 离心管收集液体。⑧300×g 离心10 min，去上清。加入10% FBSRPMI 1640 的完全培养基1 mL 重悬细胞，并取样检测细胞纯度。⑨抗人CD3-APC 染色纯化前后的细胞，流式细胞仪检测T 细胞纯度，T 细胞纯度＞95%用于后续实验。

1.3 流式细胞术检测静息T细胞存活率

实验前将NMHC 溶于DMSO，浓度为40 mmol·L-1，分装保存于-80℃冰箱。临用前用10% FBS-RPMI 1640完全培养基稀释药物。

纯化后的静息T细胞（1×109L-1）接种于96孔板中，每孔1×105细胞。细胞分为细胞对照组及NMHC 0.5，2和8 μmol·L-1组。细胞对照组加含0.1%DMSO的10% FBS-RPMI 1640 完全培养基，NMHC 组加入不同浓度的NMHC，每孔体积共200 μL。每组设3 复孔，共培养96 h后，采用PI（1 mg·L-1）染色。结合流式细胞术［14］检测活细胞（PI-）数量（number，N），计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（NNMHC组/N细胞对照组）×100%。实验重复2次。

1.4 流式细胞术检测活化T细胞增殖率

用0.1% PBS-BSA 溶液调整静息T 细胞密度为1×109L-1，加入CFSE 浓度至2.5 μmol·L-1，37℃水浴锅中孵育15 min。染色结束后，离心洗涤2次，最后加入10% FBS-RPMI 1640 完全培养基重悬，调整细胞密度为2×109L-1。T 细胞活化［15］步骤为：①提前12 h 预先包被抗人CD3 单抗（2.5 mg·L-1）于96 孔培养板表面，每孔50 μL；②去除包被液，用PBS 清洗1次，再加入纯化后标记了CFSE的静息T细胞（每孔100 μL）和抗人CD28 抗体（0.625 mg·L-1，每孔50 μL），孵育96 h，使细胞活化增殖。

细胞分组：双抗未刺激组（静息T细胞接种于不含抗CD3/28 抗体的96 孔板中）、双抗刺激组（静息T 细胞经抗CD3/28 抗体刺激，同1.4）及双抗刺激+NMHC（0.125，0.5，2 和8 μmol·L-1）组（静息T 细胞加入到抗CD3 抗体包被的96 孔细胞板中，加入抗CD28 抗体和不同浓度NMHC），均于含0.1%DMSO 的10% FBS-RPMI 1640 完全培养基培养，每孔1×105细胞，培养体系为200 μL。培养96 h 后按1.3检测活细胞数量（N），计算药物的抑制率。药物抑制率（%）=（N双抗刺激+NMHC组-N双抗未刺激组）/（N双抗刺激组-N双抗未刺激组）×100%。每组设3复孔，实验重复2次。

1.5 流式细胞术检测CD25表达

纯化后的静息T 细胞（1×109L-1）接种于96 孔板中，每孔1×105细胞。细胞分组：双抗未刺激组和双抗刺激组，处理同1.4；双抗刺激+NMHC 或LY294002 组为抗CD3/CD28 抗体刺激的T 细胞与不同浓度的NMHC（0.5，2 和8 μmol·L-1）或LY294002（50 μmol·L-1）作用，培养体系为200 μL。每组设3 复孔。48 h 后收集各组细胞，加入抗CD25-APC 对T 细胞避光染色30 min，流式细胞仪检测T细胞表面CD25表达。

1.6 流式细胞术检测细胞周期

纯化后的静息T 细胞（1×109L-1）接种于96 孔板中，每孔1×105细胞。细胞分组：双抗未刺激组和双抗刺激组，处理同1.4；双抗刺激+NMHC 或西罗莫司组为抗CD3/CD28 抗体刺激的T 细胞与不同浓度的NMHC（0.5，2 和8 μmol·L-1）或西罗莫司（0.1 μmol·L-1）作用，培养体系为200 μL。每组设3 复孔。培养72 h 后，收集细胞用70%预冷乙醇500 μL 固定，4℃过夜。染色前先离心去除固定液，每管加入RNA 酶：PI=1∶9 的染色工作液500 μL，室温避光30～60 min 后用流式细胞仪测定细胞周期G0/G1，G2和M期的百分比［16］。实验重复3次。

1.7 ELISA检测上清液中IL-2，IL-6，IL-17A和IFN-γ水平

纯化后的静息T 细胞（1×109L-1）接种于96 孔板中，每孔1×105细胞。细胞分组：双抗未刺激组和双抗刺激组，处理同1.4；双抗刺激+NMHC 或LY294002组为抗CD3/CD28抗体刺激的T细胞与不同浓度的NMHC（0.5，2 和8 μmol·L-1）或LY294002（50 μmol·L-1）作用。各组培养24或48 h后，收集上清，用ELISA 试剂盒检测24 h 上清中IL-2 水平和48 h上清中IL-6，IL-17A和IFN-γ水平［16］。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 分选T细胞纯度鉴定

采用密度梯度离心法分离出人外周血中PBMC，分离后的PBMC 按人T 细胞分选试剂盒阴性分选人T 细胞，流式细胞术检测T 细胞纯度。结果（图1）显示，分选前T 细胞纯度为58.1%，分选后≥95%，可用于后续实验。

Fig.1 Purity of resting T cells examined by flow cytometry before and after sorting. A：human periph⁃eral mononuclear cells（PBMCs）isolated from peripheral blood by Lymphoprep；B：PBMCs sorted by using the naive pan T cell isolation kit.

2.2 NMHC对静息T细胞存活的影响

结果（图2）显示，与细胞对照组相比，NMHC 0.5，2 和8 μmol·L-1组细胞存活率分别为（102±6）%，（104±5）%和（100±4）%，表明NMHC对静息T细胞均无明显的细胞毒性。

Fig.2 Cytotoxicity of N-methylhemeanthidine hydro⁃chloride（NMHC）on naive T cells. Naive T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 for 96 h. Cell viability was measured by flow cytometry.±s，n=3.

2.3 NMHC对活化T细胞增殖的影响

如图3 所示，双抗刺激+NMHC 0.125 μmol·L-1组活化T细胞增殖率与双抗刺激组相近，双抗刺激+NMHC 0.5，2和8 μmol·L-1组随NMHC 浓度增加逐渐降低，其中8 μmol·L-1组与双抗未刺激组相近，表明NMHC 显著抑制抗人CD3/CD28 活化的T 细胞增殖，其IC50为（0.28±0.06）μmol·L-1。

Fig.3 Effect of NMHC on proliferation of activated T cells detected by flow cytometry. The CFSE-labeled T cells were treated with or without NMHC 0.125，0.5，2 and 8 μmol·L-1 and stimulated with or without anti-human-CD3/CD28 mAbs for 96 h，then measured by flow cytometry.B was the quantitative analysis result of A.±s，n=3.

2.4 NMHC对活化T细胞CD25表达的影响

如图4 所示，药物与活化T 细胞作用48 h，与双抗刺激组比较，双抗刺激+LY294002 组活化T 细胞CD25 表 达 被 显 著 抑 制（P＜0.05），双 抗 刺 激+NMHC 0.5 μmol·L-1组CD25 表达无明显变化，双抗刺激+NMHC 2和8 μmol·L-1组CD25+细胞百分率明显降低（P＜0.05）。因此，NMHC 2和8 μmol·L-1可显著抑制T细胞活化。

2.5 NMHC对活化T细胞周期的影响

Fig.4 Effect of NMHC on CD25 expression of activated T cells detected by flow cytometry. T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 or LY294002 50 μmol·L-1 and activated with or without anti-human-CD3/CD28 mAbs for 48 h. B was the quantitative analysis result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with T cells activated by anti-CD3/CD28 mAbs without drug group.

Fig.5 Effect of NMHC on cell cycles of activated T cells detected by flow cytometry. T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 or sirolimus（Sir）0.1 μmol·L-1 and activated with or without anti-human-CD3/CD28 mAbs for 72 h.B was the quan⁃titative analysis result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with T cells activated by anti-CD3/CD28 mAbs without drug group.

细胞周期检测结果（图5）表明，NMHC 与活化T 细胞作用72 h，对细胞周期的影响与免疫抑制剂西罗莫司相似。NMHC 2 和8 μmol·L-1时，G0/G1期细胞百分比明显增加（P＜0.05），S 期细胞百分比减少（P＜0.05），表明NMHC 可抑制细胞内DNA合成，阻滞活化T细胞周期于G0/G1期，从而抑制活化T细胞增殖。

2.6 NMHC对活化T细胞分泌细胞因子水平的影响

图6 所示，与双抗刺激组相比，双抗刺激＋NMHC 0.5，2 和8 μmol·L-1组促炎因子IL-2，IL-6，IFN-γ 和IL-17A 水平明显降低（P＜0.05），表明NMHC 对促炎细胞因子IL-2，IL-6，IFN-γ 和IL-17A的分泌具有显著抑制作用。

Fig.6 Effect of NMHC on cytokine production in activated T cells detected by ELISA. T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 or LY294002 50 μmol·L-1 and activated with anti-human-CD3/CD28 mAbs for 24 or 48 h. ±s，n=3. ＊P＜0.05，compared with T cells activated by anti-CD3/CD28 mAbs without drug group.

3 讨论

NMHC 是一种新型的石蒜科生物碱［18］，可通过激活NOTCH 信号通路抑制急性髓系白血病细胞增殖［19］，或通过下调蛋白激酶B 活化抑制胰腺癌细胞增殖。但其对活化T细胞的作用尚未见报道。

静息T 细胞受抗CD3 和CD28 抗体共刺激后，通过激活钙调磷酸酶、丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB信号通路，引起活化T 细胞核因子、激活蛋白1 和NF-κB 转录因子的活化。活化的转录因子启动下游基因表达，如IL-2和CD25。IL-2与CD25结合后激活下游JAK3-STAT5通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-核糖体S6 蛋白激酶等信号通路，向细胞内传递增殖信号，从而启动细胞周期，使T细胞增殖［21］。本研究结果表明，NMHC 对T 细胞活化具有显著抑制作用，其IC50为（0.28±0.04）μmol·L-1，浓度达8 μmol·L-1时对人静息T 细胞无明显的细胞毒性。CD25 表达和IL-2 分泌是T细胞活化的标志［22］。NMHC可抑制活化T细胞CD25 的表达和IL-2 的分泌，表明NMHC 主要作用于T 细胞的活化阶段。同时，NMHC 还将细胞周期阻滞于G0/G1期，表明NMHC 作用机制可能与阻断T细胞活化阶段的关键信号通路有关。

活化T 细胞可分化为辅助性T 细胞（helper T cell，Th）1，Th2，Th17 和Treg 细胞，细胞因子是参与免疫调节的信号分子，主要由Th 细胞产生［23］。但如果免疫系统被侵袭引起体液中多种促炎细胞因子大量分泌，会出现“细胞因子风暴”，危及患者生命［24］。本研究结果显示，NMHC 显著抑制促炎细胞因子IL-6，IL-17A 和IFN-γ 的分泌，表明NMHC抑制T 细胞增殖的同时，可抑制其促炎细胞因子的分泌。

综上所述，NMHC 主要通过抑制CD25 表达和IL-2 分泌、阻滞细胞周期于G0/G1期，进而选择性地抑制活化T 细胞增殖。现有的免疫抑制剂中，环孢素和他克莫司通过选择性抑制T细胞活化发挥免疫抑制作用［24］，已在临床上用于治疗异体器官或骨髓移植的排异反应、类风湿性关节炎和重症肌无力等免疫性疾病。由此提示，NMHC 有可能成为潜在的免疫抑制先导化合物，但待进一步探索。