光谱法和分子对接法研究盐酸雷尼替丁与溶菌酶的相互作用

史博文，李蕴哲，杜 研，宋 宁

（1.西安交通大学药学院，陕西 西安710061；2.西安国际医学中心麻醉手术中心，陕西 西安710075）

盐酸雷尼替丁又名呋喃硝胺，是一种选择性H2受体拮抗剂，临床上常用于治疗消化性溃疡、急性上消化道出血、反流性食管炎和胃泌素瘤等［1］。盐酸雷尼替丁还经常与维生素C联合治疗复发性口腔溃疡［2］，与咪唑斯汀联合治疗慢性特发性荨麻疹［3］。

溶菌酶是一种小分子碱性蛋白质，由130 个氨基酸残基组成［4］。它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆和乳汁中［5］，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和增强免疫等药理作用。溶菌酶是药物发挥药效的一种重要载体，常作为模型蛋白用于研究药物小分子与蛋白质的相互作用，为研究药物在体内的分布、代谢、药效的发挥等提供依据［6-8］。目前，曹团武等［9］对盐酸雷尼替丁与牛血清白蛋白之间相互作用进行了研究，而其与溶菌酶之间的作用机制尚未见报道。

光谱法因其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点成为小分子物质与蛋白（酶）相互作用的主要研究手段［10-11］。本研究采用荧光光谱法研究盐酸雷尼替丁与溶菌酶的作用，重点观察二者相互作用的结合常数、结合位点数以及相关热力学参数，利用同步荧光光谱法、紫外光谱法、三维荧光光谱等研究其对溶菌酶构象的影响，并应用分子对接模拟盐酸雷尼替丁与溶菌酶之间可能存在的作用形式，为阐明盐酸雷尼替丁在体内的分布和代谢过程提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

盐酸雷尼替丁（中国药品食品研究院），用甲醇溶解并配制成2.85 mmol·L-1的储备液；溶菌酶（分析纯，北京索宝莱科技有限公司），用Tris-HCl 缓冲液溶解并配制成1.0 μmol·L-1的标准储备液；Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4，含0.1 mol·L-1NaCl 维持溶液的离子强度）；所有储备液均于4℃冰箱保存备用。

RF-5301pc 型荧光分光光度计、UV-2450 型紫外分光光度计和AY210 分析天平（日本岛津公司）；1810b 型超纯水机（上海摩勒生物科技有限公司）；XW-80A 旋混合器（上海驰唐电子有限公司）；DF-101 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 实验原理

使用Stern-Volmer 曲线方程［12］式①分析盐酸雷尼替丁与溶菌酶相互作用的猝灭机制：

式①中，F0：荧光强度（不加猝灭剂）；F：荧光强度（加入猝灭剂）；Kq：双分子表观猝灭常数；τ0：无猝灭剂条件下，荧光分子的平均寿命（约为10-8s）；Ksv：猝灭速率常数；［Q］：猝灭剂浓度。

根据不同温度下Ksv的变化可以判断猝灭类型。若Ksv随温度的升高而增大，则说明猝灭过程为动态猝灭；若Ksv随温度的升高而减小，说明猝灭过程为静态猝灭。同时，双分子表观猝灭常数Kq的最大值为2×1010L·mol-1·s-1，若Kq值远大于该极限值，则说明猝灭机制为静态猝灭。

对于静态猝灭，其结合常数K 和结合位点数n可使用方程式②，式③，式④进行计算［13］：

式②中，K：温度为T时的结合常数；n：结合位点数。

利用Van't Hoff 方程［14］分析盐酸雷尼替丁与溶菌酶之间的作用力类型：

式③和④中，K：温度为T 时的结合常数；ΔH：反应焓变；R：普适气体常量；T：绝对温度；ΔS：反应熵变；ΔG：反应的标准摩尔吉布斯自由能变。

小分子药物与蛋白（酶）的作用力类型可以根据ΔH 和ΔS 的值来判断：若ΔH＞0，ΔS＞0，则是典型的疏水作用力；若ΔH＜0，ΔS＞0，则是静电作用力；若ΔH＜0，ΔS＜0，则表明是氢键和范德华力；若ΔG＜0，则表明反应过程是自发进行的。

根据Förster 非辐射能量转移理论［15］，小分子物质与荧光发射基团间的能量转移效率（E）和结合距离（r）可通过式⑤计算得出：

式⑤中，R0：转移效率为50%时的临界距离；R0可由式⑥计算得出：

式⑥中，K2：偶极空间取向因子；N：介质折射指数；Φ：供能体的荧光量子产率；J：供能体的荧光发射光谱和受能体的紫外吸收光谱的重叠积分；J 可由式⑦计算得出：

式⑦中，F（λ）：供能体在波长λ 处的荧光强度；ε（λ）：受能体在波长λ 处的摩尔吸光系数；Φ：供能体的荧光量子产率；J：供能体的荧光发射光谱和受能体的紫外吸收光谱的重叠积分。

由文献［16］可知，K2=2/3，溶菌酶的N=1.40，Φ=0.15［17］。当供能体与受能体间的距离足够接近，r＜7 nm 时，则说明小分子药物与蛋白（酶）之间发生了能量转移。

通过同步荧光法判断蛋白（酶）生色团附近微环境的变化。当Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 时，相对应的荧光信号的改变分别反映的是酪氨酸和色氨酸残基所处微环境的改变情况［18］。若蛋白（酶）中酪氨酸和色氨酸残基的最大荧光发射波长发生红移，说明氨基酸残基所在的环境极性增加，肽链的伸展程度增加；若发生蓝移则刚好相反。

1.3 荧光猝灭光谱法测定盐酸雷尼替丁和溶菌酶的结合类型

在25℃（298 K），30℃（303 K）和37℃（310 K）温度下，精密量取10 mL溶菌酶1.0 μmol·L-1储备液于试管中，逐次加入盐酸雷尼替丁储备液，每次2 μL，涡旋，恒温水浴5 min。狭缝宽度为5 nm，激发波长（λex）设为282 nm，在290～410 nm 范围内扫描荧光光谱，记录最大发射波长（λem）处荧光强度变化。

1.4 能量转移法测定盐酸雷尼替丁和溶菌酶的结合距离

精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1储备液于试管中，于25℃恒温水浴5 min，于荧光光谱仪上测定发射光谱，获得溶菌酶溶液在290～400 nm 范围内的荧光光谱。

另精密量取10 mL Tris-HCl（pH 7.4）缓冲溶液于离心管中，然后加入一定量的盐酸雷尼替丁溶液，使得药物浓度等于溶菌酶储备液的浓度，于紫外光谱上记录290～400 nm的紫外吸收光谱。

1.5 同步荧光光谱法测定溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基微环境

室温下，操作方法同1.3。以Δλ=15 nm和Δλ=60 nm 测定其同步荧光光谱，检测加药前后酪氨酸和色氨酸残基荧光峰位的变化。

1.6 紫外吸收光谱法测定溶菌酶结构

精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1储备液于试管中，逐次加入盐酸雷尼替丁储备溶，每次2 μL，涡旋，25℃反应5 min，在200～400 nm 范围内扫描溶菌酶-盐酸雷尼替丁体系的紫外光谱，检测加药前后溶菌酶特征紫外吸收峰的强度和位置的改变。

1.7 三维荧光光谱法测定溶菌酶结构

精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1储备液于试管中，于25℃恒温水浴5 min，于荧光光谱仪上测定其220～500 nm 范围内的三维荧光光谱。将初始λex设为220 nm，随后每增加2 nm 测定1 次λem，直至λex设置为400 nm。

另精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1储备液于试管中，于25℃恒温水浴5 min，然后加入一定量的盐酸雷尼替丁溶液至离心管中，使得药物浓度等于溶菌酶储备液的浓度，恒温反应5 min后，同法测定溶菌酶-盐酸雷尼替丁体系的三维荧光光谱，检测加药前后溶菌酶三维荧光特征峰的强度和位置的改变。

1.8 分子对接法模拟盐酸雷尼替丁与溶菌酶的结合

利用Molecular Operating Environment（MOE）软件进行分子对接模拟，模拟小分子与溶菌酶的结合位点和结合后的可能构象。盐酸雷尼替丁的分子结构从Chemical Book 中下载Mol 文件，溶菌酶的晶体结构（PDB 编码为4D9Z）从RCSB 下载。模拟前去除溶菌酶三维晶体结构中的水分子、离子及与小配体药物无关的其他杂配体，然后将优化后的溶菌酶晶体结构和雷尼替丁在MOE 中进行分子对接，获得最可能的结合构象。

2 结果

2.1 盐酸雷尼替丁对溶菌酶荧光猝灭机制的分析

在荧光猝灭光谱中，盐酸雷尼替丁在25，30 和37℃下均可使溶菌酶的荧光产生猝灭。当向试管中不断加入盐酸雷尼替丁，使其浓度不断增加时，溶菌酶的荧光强度降低。由此可推测，盐酸雷尼替丁与溶菌酶发生了相互作用。图1为盐酸雷尼替丁在25，30及37℃时对溶菌酶荧光的影响。

盐酸雷尼替丁的猝灭曲线如图2 所示，其线性方程及相关参数见表1。据表1 可知，盐酸雷尼替丁与溶菌酶相互作用的Ksv随温度升高而增大，初步判断其猝灭机制为动态猝灭，但是由于双分子表观猝灭常数Kq值远大于2.0×1010L·mol-1·s-1，说明其引起溶菌酶荧光猝灭的主要原因是形成了复合物，即其猝灭机制以静态猝灭为主，动态猝灭仍占有一定比例。

2.2 盐酸雷尼替丁和溶菌酶的结合常数与结合位点数

Fig.1 Fluorescence quenching spectra of lysozyme（Lys）by ranitidine hydrochloride at 25℃（298 K，A），30℃（303 K，B）and 37℃（310 K，C）. 1-11：the concentra⁃tion of ranitidine hydrochloride was 0，0.57，1.14，1.71，2.28，2.85，3.14，3.99，4.56，5.13 and 5.70 μmol·L-1，respectively.

Fig.2 Stern-Volmer plots for fluorescence quenching of Lys by ranitidine hydrochloride at different tempera⁃tures. F：fluorescence intensity（quencher presence）；F0：fluorscence intensity（quencher absence）；[Q]：concentration of quencher.

盐酸雷尼替丁对溶菌酶作用的双对数曲线图（图3）所示，其结合常数和结合位点数见表2。由表2 可知，在25℃时，盐酸雷尼替丁的结合位点数n为0.72，表明其在25℃下与溶菌酶可能通过一个结合位点进行结合。而在30 和37℃时其结合位点数n 约为0.5，推测1 个溶菌酶可与2 个药物小分子结合。同时，盐酸雷尼替丁的结合常数和结合位点数均随着温度的升高而减小，说明温度升高可能会破坏药物与溶菌酶形成配合物的稳定性，进一步说明其作用机制为静态猝灭。

Tab.1 Stern-Volmer equation and parameters for ranitidine hydrochloride binding to Lys

Fig.3 Plots of lg［（F0-F）/F］against lg［Q］for binding constant of Lys.

Tab.2 Binding constants and binding sites for raniti⁃dine hydrochloride binding to Lys

2.3 盐酸雷尼替丁与溶菌酶的主要作用力类型

以lnK 对1/T做线性回归，由直线的斜率和截距即可得到盐酸雷尼替丁与溶菌酶结合过程的焓变ΔH为-177.25 kJ·mol-1、熵变ΔS为-540.97 J·mol-1·K-1及盐酸雷尼替丁在25，30 和37℃下与溶菌酶相互作用，标准摩尔吉布斯自由能变ΔG 分别为-16.05，-13.34 和-9.55 kJ·mol-1。ΔG＜0 说明其相互作用过程是自发进行的；ΔH＜0，ΔS＜0 说明其与溶菌酶主要作用力类型为氢键和范德力。

2.4 盐酸雷尼替丁与溶菌酶的结合距离

实验结果显示，溶菌酶荧光发射光谱与盐酸雷尼替丁溶液的紫外吸收光谱之间具有重叠（图4）。根据Förster非辐射能量转移理论计算可知，溶菌酶与盐酸雷尼替丁的能量转移效率E=0.87，重叠积分J=5.59×10-15cm3·L·mol-1，r=1.63 nm（＜7 nm），表明蛋白与药物之间发生了非辐射能量转移。

Fig.4 Overlap of fluorescence spectra of Lys and absorp⁃tion spectrum of ranitidine hydrochloride. The concen⁃tration of Lys and ranitidine hydrochloride was both 1.0 μmol·L-1.UV：ultraviolet spectroscopy；FLU：fluorescence spectroscopy.

2.5 盐酸雷尼替丁对溶菌酶色氨酸和酪氨酸残基微环境的影响

图5 表示在室温条件下，盐酸雷尼替丁与溶菌酶在Δλ=15 nm（酪氨酸残基）和Δλ=60 nm（色氨酸残基）时相互作用的同步荧光光谱。结果显示，随着盐酸雷尼替丁浓度的增加，酪氨酸残基和色氨酸残基的荧光强度降低，在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm时峰位未发生明显改变，表明色氨酸和酪氨酸残基所处的微环境未发生明显变化。

2.6 盐酸雷尼替丁对溶菌酶芳香族氨基酸微环境的影响

紫外吸收光谱结果表明（图6），溶菌酶在280 nm附近有最大吸收，随着盐酸雷尼替丁浓度的增加，溶菌酶的吸光度依次增加，表明溶菌酶与盐酸雷尼替丁相互作用，并且由于这种相互作用，溶菌酶与盐酸雷尼替丁之间形成了基态复合物，进一步说明其与溶菌酶发生荧光猝灭的作用机制为静态猝灭。同时，盐酸雷尼替丁对溶菌酶的紫外吸收光谱在280 nm 附近发生明显的红移，表明芳香族氨基酸的微环境亲水性增强。

2.7 盐酸雷尼替丁对溶菌酶肽链骨架的影响

Fig.5 Effect of ranitidine hydrochloride on synchro⁃nous fluorescence spectra of Lys at Δλ=15 nm（A）and Δλ=60 nm（B）. The concentration of Lys was 1.0 μmol·L-1；1-11：concentration of ranitidine hydrochloride was 0，0.57，1.14，1.71，2.28，2.85，3.14，3.99，4.56，5.13 and 5.70 μmol·L-1，respectively.

Fig.6 Effect of ranitidine hydrochloride on ultraviolet spectrum of Lys. 1-11：The concentration of ranitidine hydro⁃chloride was 0，0.57，1.14，1.71，2.28，2.85，3.14，3.99，4.56，5.13 and 5.70 μmol·L-1，respectively.

三维荧光结果显示（图7，表3），在室温下加入盐酸雷尼替丁后，酪氨酸和色氨酸残基的荧光特征峰A 及溶菌酶肽链骨架的特征吸收峰峰B的强度均降低，表明盐酸雷尼替丁对溶菌酶肽链骨架有影响。

Fig.7 3D fluorescence spectra of Lys in absence（A）and presence（B）of ranitidine hydrochloride. The concen⁃trations of Lys and ranitidine hydrochloride were both 1.0 μmol·L-1.Peak1 and peak2 represent the primary and secondary Rayleigh scattering peaks；peak A represents the characteristic absorp⁃tion peaks of tyrosine and tryptophan residues；peak B repre⁃sents the characteristic absorption peaks of the lysozyme peptide chain backbone［19］.ex：excitation；em：emission.

2.8 雷尼替丁与溶菌酶结合分子对接

雷尼替丁的分子对接结果如图8 所示，根据分子模拟对接结果可知，雷尼替丁在Ser72 周围与溶菌酶通过氢键进行相互作用，并存在2 个氢键。结合位点周围的氨基酸残基有Arg68，Thr69，Asp66，Gly67，Asn65，Ser72，Arg73和Asn74。

Tab.3 3D fluorescence characteristic parameters of Lys in absence and presence of ranitidine hydrochloride

Fig. 8 2D simulation results of molecular docking between ranitidine hydrochloride and Lys.：the hydrogen bond between the acceptor and the ligand，the donor is located at the root of the arrow，and the acceptor is located at the head. The hydrogen bond is formed in the side chain of the residue.

3 讨论

本研究运用荧光光谱、同步荧光光谱、紫外光谱、Förster 非辐射能量转移理论、三维荧光光谱及分子对接研究了盐酸雷尼替丁与溶菌酶的相互作用。荧光猝灭实验表明，盐酸雷尼替丁与溶菌酶的作用机制为静态猝灭，但动态猝灭仍占一定比例。在25℃时，盐酸雷尼替丁的n 为0.72，表明其在25℃下与溶菌酶可能通过1个结合位点结合。而在30和37℃时n约为0.5，可推测1个溶菌酶可与2个药物小分子结合。同时，盐酸雷尼替丁的K 和n 均随着温度的升高而减小，说明温度升高可能会破坏药物与溶菌酶形成配合物的稳定性，进一步说明其作用机制为静态猝灭。溶菌酶与盐酸雷尼替丁的相互作用是自发进行的，主要作用力类型为氢键和范德华力。根据Förster非辐射能量转移原理，其与溶菌酶间产生了能量转移。根据同步荧光光谱、紫外光谱和三维荧光光谱可知，盐酸雷尼替丁与溶菌酶结合时对酶的构象有影响。分子对接结果表明，雷尼替丁与Ser72残基形成了2个氢键。探讨药物分子与溶菌酶之间的相互作用可为阐明外源药物在生物体内的转运过程和作用机制提供理论基础，有助于药动学研究。