加味四逆散对大鼠肝纤维化的改善作用*

晁利芹 王 付

河南中医药大学中医药科学院 (河南 郑州， 450046)

肝纤维化是肝损伤发展至肝硬化的中间环节，及时阻断或逆转肝纤维化的发生至关重要，但西药抗纤维化毒副作用较大，寻找毒副作用小的中医药治疗方法成为了当今热点。肝纤维化属于中医的“郁证”、“胁痛”、“痞满”、“腹痛”、“积聚”、“癥瘕”、“鼓胀”等范畴，病机符合肝气郁滞、脾胃虚弱、络脉瘀阻[1]，治以加味四逆散，疏肝健脾、益气养血，可阻断或逆转肝纤维化，且毒副作用小。本研究探讨了加味四逆散对猪血清诱导的大鼠免疫损伤性肝纤维化的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验药物 加味四逆散由柴胡、枳实、白芍、人参、白术、茯苓、炙甘草、昆布各10 g所组成，实验所用中药材购自河南中医药大学第三附属医院，水煎并浓缩为含生药3.75 g/ml的药液，4℃冰箱保存备用。秋水仙碱片(西双版纳制药厂)研碎，用0.2%羧甲基纤维素钠配制0.75‰混悬液。

1.2 实验动物及饲料 SPF级雌性 Wistar大鼠100只，体重(120±10)g，由河南省实验动物中心提供，许可证号〔SCXK(豫)2017-0001〕；动物颗粒饲料，购于河南省实验动物中心，许可证号〔SCXK(豫)2015-0005〕。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组 本研究获得河南中医药大学实验动物伦理委员会许可，大鼠按照河南中医药大学实验动物保护与使用规则饲养。实验室相对封闭，自然采光良好，实验室相对温度控制在 20～25℃之间，相对湿度控制在60%左右，12 h明暗交替，自由摄食进水。适应性饲养7 d后，100只大鼠按体重随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组、加味四逆散组、预防组，每组20只。

1.3.2 肝纤维化模型制备 参考文献报道方法用猪血清诱导免疫损伤性肝纤维化模型[2-4]。除正常组外，其余各组均腹腔注射未灭活的猪血清，0.5 ml/次/只，每周两次；第5周之后，每2～3只大鼠关在一笼内，用尖端包纱布的止血钳钳夹其中一鼠鼠尾，使其保持激怒状态并与同笼鼠争斗撕咬，以不破皮流血为度，每次刺激5 min，2次/d，同时每周皮下注射0.1%肾上腺素0.2 ml；隔2日喂食，喂食日食量不限，8周后即可形成气郁脾虚瘀阻证肝纤维化。

动物模型成功判定：空白组和参与造模组之间，血清肝功能、肝纤维化指标差异显著，肝纤维化大鼠肝脏组织病变明显，胶原沉积。

1.3.3 给药方法 预防组大鼠于造模同时给药，每天按7 mg/kg剂量给予疏肝健脾通络法方药灌胃，连续给药16周；造模后第9周，模型组和空白组大鼠分别给予与预防组等量的生理盐水灌胃，加味四逆散组大鼠每天按7 mg/kg剂量给予加味四逆散药液灌胃，秋水仙碱组大鼠每天按0.2 mg/kg剂量给予0.75‰秋水仙碱混悬液，至第16周末结束。

1.3.4 实验样品收集 末次灌胃后，大鼠禁食不禁水2 h，腹主动脉取血后4℃ 3 000 r/min离心15 min，收集血清，于-80℃保存备用。采血完毕后，剖腹迅速取出完整肝叶，用冷盐水漂洗除去表面血液，滤纸拭干称重，计算肝脏系数，肝脏系数可以大体判断脏器病变的程度和性质，肝脏系数(%)=肝质量(g)/体质量(g)×100。除净周围的结缔组织，取肝右叶置于-80℃低温冰箱保存、备检。取肝左叶立即置于10%甲醛溶液固定48 h，脱水、包埋、切片，MASSON染色后在光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.3.5 观察指标 ①一般中医症候指标，包括体重、外观行为(毛发色泽、行为、饮食、精神状态等)；②肝功能指标，包括血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、球蛋白(Glo)、白蛋白(Alb)、白球比(A/G)、总蛋白(TP)；③肝纤维化指标，包括Ⅲ型前胶原氨基末端肽(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)；④大鼠肝组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA 表达水平。

2 结果

2.1 加味四逆散对实验大鼠一般情况的影响 实验结束，空白组大鼠精神状态良好，行动灵巧，皮毛有光泽，食欲佳，大便正常。模型组大鼠精神萎靡不振，行动迟缓，懒动，皮毛无光泽，纳差，腹胀，腹泻。加味四逆散组大鼠皮毛光滑，活动力强，饮食尚可，大便可，体重有所增加。

2.2 加味四逆散对实验大鼠肝脏系数的影响 见表1。

表1 各组实验大鼠肝脏系数的比较

2.3 加味四逆散对实验大鼠肝功能的影响 加味四逆散能有效改善实验大鼠肝功能，降低肝损伤程度，但在实验阶段大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT含量还不能恢复至正常范围，见表2。加味四逆散可提高实验大鼠肝脏合成蛋白质的能力，改善肝脏损伤程度，见表3。

2.4 加味四逆散对实验大鼠肝纤维化指标的影响 加味四逆散可以降低大鼠肝纤维化水平，对大鼠肝纤维化具有改善作用，见表4。

2.5 加味四逆散对大鼠肝组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA表达的影响 加味四逆散组可以降低大鼠肝组织中TGF-β1、Smad3 mRNA表达水平，保持Smad7 mRNA表达水平，见表5。

表2 各组实验大鼠肝功能的比较

表3 各组大鼠血清蛋白含量及A/G的比较

表4 各组大鼠血清肝纤维化指标的比较

表5 各组大鼠肝组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA水平的比较

2.6 加味四逆散对实验大鼠肝组织病理学变化的影响 肝脏外观观察结果：空白组大鼠肝脏表面光滑，质地柔软，边缘锋利；模型组大鼠肝脏表面粗糙，质地偏硬，体积偏大，边缘变钝；秋水仙碱组、加味四逆散组、预防组大鼠均肝脏表面尚光滑，质地尚柔软，边缘锋存在。镜下观察MASSON染色，空白组大鼠仅见汇管区有少量的纤维组织。模型组大鼠肝脏见大量纤维组织增生，假小叶形成。秋水仙碱组、加味四逆散组、预防组大鼠均可见有较少纤维组织增生，提示其具有良好的改善疗效，见图1。

图1 各组实验大鼠肝脏组织病理改变图(MASSON染色，400×)

3 讨论

肝硬化或肝癌是严重危害人民健康的重大疾病，具有较高的致病率、致死率，严重危害人类健康，给患者身心带来极大痛苦，增加家庭及社会的经济负担。肝纤维化是慢性肝病与肝硬化、肝癌的中间环节，及时阻断或逆转肝纤维化的发生、发展成了防治肝硬化、肝癌的关键一步。大量研究证实，中药复方在防治肝纤维化的方面具有一定优势。本研究主要探讨基于疏肝健脾通络法下的加味四逆散抗肝纤维化的作用机制。

采用腹腔注射猪血清制备免疫损伤性肝纤维化模型，能反映肝纤维化的发病机制与病理变化。猪血清中白蛋白是外来异体抗原，多次注射可引起变态反应，加剧血管内皮细胞的损伤，促进血小板聚集和红细胞聚集，肝纤维化成模后，联合止血钳钳夹鼠尾激怒法及暴饮暴食的隔日喂食的脾虚方法，从而使造模动物产生肝郁脾虚络瘀证的病理状态，并与肝郁脾虚络瘀证的中医病机相符合。本研究采用腹腔注射未灭活猪血清联合保持激怒饥饿状态的方法，使实验大鼠肝脏系数、血清肝功能、血清肝纤维化指标显著升高，Alb、TP、A/G显著下降，肝组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达水平均显著升高，Smad7 mRNA表达水平显著下降，在灌胃加味四逆散56 d后，上述指标均有不同程度地改善，且在实验时间范围及实验剂量与药物秋水仙碱具有相近的疗效。

ALT、AST、ALP、GGT是反映肝脏功能的重要指标，当肝细胞损伤或坏死时，血液中ALT、AST、ALP、GGT的含量就会升高。肝脏是蛋白质合成的重要场所。当肝细胞受到损害，蛋白质的合成、运输、释放将会受到影响，含量会下降。加味四逆散能够降低实验大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT，减轻肝损伤、促进肝脏蛋白质合成，改善肝功能。HA、PCⅢ、CⅣ、LN是反映肝纤维化的重要指标。HA水平含量能灵敏的反映肝纤维量；PCⅢ反映肝纤维合成和炎症活动性状况；CⅣ是最初形成的纤维，可敏感地反映肝炎向肝纤维化转变发展的程度和过程，是肝纤维化早期诊断的重大指标；LN反映肝脏的受损程度，可判别是否存在活动性肝纤维化的指标。加味四逆散能够降低实验大鼠血清HA、PCⅢ、CⅣ、LN含量，改善实验大鼠肝纤维化。研究表明TGF-β/Smad信号转导通路是肝纤维化最关键的细胞信号通道。TGF-β1与肝星状细胞膜受体结合，活化该受体，继而磷酸化Smad蛋白，其中，p-Smad2、p-Smad3诱导形成TGF-β/Smad复合物，活化肝星状细胞及细胞外基质。然而，Smad7属于抑制Smad蛋白，p-Smad7的表达上调，可以抑制Smad2、Smad3的磷酸化而阻断肝星状细胞转型，减弱肝星状细胞内TGF-β/Smad信号转导，阻断胶原蛋白合成。

研究结果说明加味四逆散具有抗肝脏纤维化的治疗作用，方中柴胡疏肝解郁；枳实降气导滞，与柴胡配伍，柴胡偏于升，枳实偏于降，一升一降，调理肝脾，疏达气机；芍药益血敛肝，与柴胡配伍，柴胡偏于散，芍药偏于敛，一散一敛，调理气机；人参补益中气；白术健脾益气，与人参配伍，人参偏于生津，白术偏于燥湿；茯苓益气利湿；昆布咸、寒，入肝、肾经，软坚散结，价廉且可长期服用；甘草益气缓急，既能防柴胡疏散太过，又能防枳实降泄太过，更能助芍药收敛缓急，还能助人参、白术、茯苓健脾益气。方药相互为用，以奏疏肝健脾，益气养血，软坚散结，以此治疗可以改善肝功能及肝纤维指标，毒副作用小，值得进一步研究。