基于网络药理学研究柴胡治疗肝炎的分子作用机制

田园硕 严海艺 王心意 秦雪颖 郭 朋△

1.北京中医药大学临床医学院 (北京， 100029) 2.中国中医科学院西苑医院

肝炎是由各种原因引起的肝脏炎症的统称，根据病因可大致分为五类：病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎。我国肝炎患者群体巨大，仅病毒性肝炎患者就包含：慢性HBV感染者约7 000万例、HCV感染者约1 000万例[1,2]。可见肝炎是影响我国人民健康的重要疾病，积极开展相关研究是目前社会的迫切需求。柴胡，辛苦微寒，归肝、胆、肺经，有疏肝解郁、疏散退热之功，为“疏肝诸药之向导”。于CNKI检索肝炎的中药用药规律发现，柴胡为高频使用药物[3]，说明其在临床治疗肝炎中起重要作用，但柴胡成分多样、作用途径复杂，故其作用机制尚不明确。网络药理学通过构建“药物-靶点-疾病”网络分析药物对疾病的干预机制，为中药药理研究提供了新视角，其研究方法的整体性、系统性与中医学的“整体观念、辨证论治”不谋而合。本文拟通过网络药理学方法，对柴胡治疗肝炎的分子机制进行预测及讨论，以期为临床治疗及进一步研究提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 柴胡治疗肝炎的相关靶点预测 基于中药系统药理学分析平台(TCMSP)结合课题组文献整理所得数据，获取并筛选口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18的柴胡活性成分及作用靶点。GeneCards和OMIM 数据库检索肝炎相关基因，与柴胡作用靶点匹配，得到柴胡活性成分抗肝炎的潜在作用靶点，并绘制韦恩图。

1.2 柴胡治疗肝炎的核心靶标筛选 应用Cytoscape软件绘制“柴胡—活性成分—抗肝炎靶点”网络图，统计各个蛋白节点的节点连接度(Degree)、中心度(BC)、紧密度(CC)等特征参数，筛选Degree≥2倍中位数、BC≥中位数、CC≥中位数的靶点蛋白作为柴胡抗肝炎作用靶点，将其进行基因名和Uniprot ID标准化，并导入DisGeNET数据库，获取对应的类型。将作用靶点导入String数据库构建蛋白相互作用网络，统计各个蛋白节点的特征参数，据此筛选核心靶标，并在DisGeNET数据库获取蛋白靶标类型。

1.3 柴胡治疗肝炎的分子作用机制预测 采用Metascape 对柴胡治疗肝炎的核心靶标进行基因功能注释(GO)和GO富集分析，在生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)功能层次上进一步分析统计。根据核心靶标基因产物的功能在以及细胞中代谢途径进行KEGG信号通路分析，筛选排名靠前的生物过程或通路进行绘图。

2 结果

2.1 柴胡治疗肝炎的相关靶点 筛选出柴胡活性成分共17个，见表1；活性成分相关作用靶点93个。于GeneCards和OMIM数据库中获取与肝炎相关的基因靶点共计10 087个，与上述柴胡作用靶点比对匹配，筛选出91个柴胡治疗肝炎的潜在作用靶点并绘制韦恩图，见图1。

表1 柴胡17个活性成分基本信息

图1 柴胡活性成分作用靶点—肝炎相关靶点韦恩图

2.2 柴胡治疗肝炎的核心靶标预测

2.2.1 柴胡-活性成分-抗肝炎靶点网络构建 将上述作用靶点及其涉及的有效活性成分(共11个)导入Cytoscape软件构建“柴胡-活性成分-抗肝炎靶点”网络，共涉及104个节点，红色圆角矩形代表肝炎(hepatitis)，绿色圆角矩形代表柴胡，黄色三角形代表活性成分，蓝色圆角矩形代表作用靶点；266个边，代表各节点之的相互关联，见图2。

图2 柴胡-活性成分-抗肝炎靶点网络图

2.2.2 靶点相互作用网络的构建与核心靶标筛选 将91个靶点导入String数据库，获取靶点相互作用网络图(PPI网络图)，共涉及89个节点(其中隐藏2个游离节点RUNX1T1、DIO1)，表示由基因编码的蛋白；778条边，表示蛋白之间的关联。见图3。利用Cytoscape统计图3各个蛋白节点的特征参数，筛选Degree≥30、BC≥0.003、CC≥0.532的靶点蛋白作为柴胡抗肝炎作用的核心靶标，共计13个，将其进行基因名和Uniprot ID标准化，并导入DisGeNET数据库，获取对应的类型，见表2。结果表明，柴胡抗肝炎过程中有信号分子、转录因子、受体、酶 (激酶、水解酶、转移酶、蛋白酶等) 、酶调节剂等物质的参与。

图3 蛋白互相作用网络图

2.3 柴胡治疗肝炎的分子机制预测

2.3.1 核心靶标的基因功能分析 柴胡活性成分治疗肝炎的核心靶标GO功能富集分析，得到GO条目共5 327个，其中BP条目4 348个、CC条目402个、MF条目577个，条目数量前20位的GO条目见图4。由图4可知，柴胡抗肝炎主要涉及的功能有：①BP：对外源刺激的反应，对氧含量的反应，凋亡信号途径，细胞对氮化合物的反应，活性氧代谢过程，体液水平调节，对酸性化学物质的反应，细胞死亡的正调控，细胞因子介导的信号通路，细胞对外界刺激的反应，小分子代谢过程的调控；②CC：核染色体，转录因子复合物，受体复合体，细胞质核周区，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物，线粒体外膜，细胞质囊泡膜，质膜蛋白复合物，肌浆网，细胞外基质，肽酶复合物，蛋白-DNA 复合物；③MF：转录因子结合，核受体活性，蛋白质异二聚活性，激酶结合，泛素样蛋白连接酶结合，氧化还原酶活性，半胱氨酸型内肽酶活性与凋亡信号通路的关系，谷胱甘肽结合，激酶调节活性，氧化还原酶活性对NAD(P)H、转录辅因子结合，组蛋白激酶活性，E-box结合，内肽酶活性，通道抑制剂活性等。

表2 柴胡抗肝炎的13个核心靶标基本信息表

图4 核心靶标的GO富集分析柱状图(从左至右依次为BP、CC、MF图)

2.3.2 核心靶标的信号通路分析 筛选出前20条通路并整合绘制柱状图，见图5。具体包括：Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、AMPK信号通路、细胞色素P450对外源物质代谢的影响、MAPK信号通路、FoxO信号通路、PI3K-Akt信号通路、JAK/STAT信号通路、Wnt信号通路、HIF-1信号通路、Hedgehog等多种信号通路。提示柴胡抗肝炎靶点分散于不同的通路中，通过调节其中的环节发挥作用。

图5 作用靶点的KEGG通路富集分析柱状图

3 讨论

肝炎属于中医“胁痛”“黄疸”“积聚”“臌胀”等范畴。肝炎早期的常见临床表现有：胸胁胀满不适、脘腹痞闷及病后情绪紧张等，中医证候为肝郁气滞或肝胃不和。柴胡善疏肝解郁，可有效缓解症状，在临床上被广泛用于肝炎的治疗。网络药理学的挖掘，可进一步预测和探究柴胡治疗肝炎的可能机制，本文分别从有效成分、核心靶标、信号通路三个层次探析其作用机制。

“柴胡-活性成分-抗肝炎靶点”网络涉及11个有效成分，部分已被证实具有治疗肝炎的作用，豆甾醇能有效控制小鼠肝组织损伤，α-菠甾醇对酯多糖(LPS)诱导的炎症有显著治疗作用[4，5]。研究表明，槲皮素可能通过HO-1抑制NADPH氧化酶依赖性氧化应激从而发挥抗氧化、抗炎作用，通过PI3K/AKT/NF-κB 信号通路改善大鼠肝组织脂肪变性和炎症，通过调节凋亡和增殖通路抑制CK2α肝癌[6-8]。异鼠李素通过抑制TGF-β/Smad信号通路、减轻氧化应激以抑制肝星状细胞活化，减轻肝纤维化[9]；通过P38/PPAR-α途径抑制细胞凋亡和自噬，降低血清肝酶和促炎细胞因子水平，改善小鼠病理损伤[10]。山奈酚调节内质应力-Grp78-CHOP信号通路，抑制肝细胞凋亡，保护小鼠肝脏功能[11]；还可调节肠道黏膜蛋白预防性治疗小鼠急性酒精性肝损伤[12]。

通过PPI网络及特征参数筛选出13个柴胡活性成分治疗肝炎的核心靶标，分别为：IL6、EGFR、PPARG、MAPK8、CASP3、ESR1、VEGFA、MYC、FOS、AR、CCND1、ERBB2、RELA，这些靶蛋白作为信号分子、转录因子、受体、酶、酶调节剂等参与肝炎病理过程。IL6是重要的炎症因子，临床研究发现，乙型肝炎患者较健康人血清IL6水平升高，且升高程度与病情相关[13]。EGFR是乙型肝炎病毒内化进入宿主的辅因子，增强宿主细胞ErbB2和EGFR表达可促进丙型肝炎病毒RNA复制、增强传染性[14，15]。PPARG与脂代谢相关，能够调控脂肪酸氧化及炎症相关的基因[16]。MAPK蛋白激酶能被体内外多种刺激因素激活，介导细胞内重要炎症反应信号通路。CASP3为细胞凋亡蛋白酶，慢性乙型肝炎患者外周血CASP3显著升高且与肝功能损伤程度密切相关[17]。部分核心靶标蛋白与癌症发生相关，VEGF是目前己知最强烈的血管发生蛋白，可促进肝癌新生血管及癌细胞的侵袭和转移；原癌基因MYC、FOS与肝癌密切相关；AR亦可能在肝癌发生中发挥作用[18]。有研究证明柴胡活性成分通过作用靶标蛋白影响肝炎进展，柴胡皂苷d(SSd)可以通过ESR抑制大鼠肝星状细胞(HSC)的增殖与活化，减少细胞外基质的沉积[19]；SSd可抑制VEGF的活性，并对大鼠肝癌形成具有一定的抑制作用[20]；SSd的抑癌作用可能与下调C-myc表达有关[21]。目前CCND1、RELA肝炎相关的研究仍较少。

KEGG通路分析显示，柴胡活性成分治疗肝炎的核心靶标显著富集于Toll样受体(TLR)信号通路、RIG-I样受体信号通路、AMPK信号通路、细胞色素P450信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路、PI3K-Akt信号通路、JAK/STAT信号通路、Wnt信号通路、HIF-1信号通路、Hedgehog信号通路等。肝炎的病因及病理过程复杂，不同病因所致肝炎涉及的通路不同，病毒性肝炎与Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路关系密切，二者可识别病毒相关分子模式，诱导炎症因子或干扰素的表达[22,23]。柴胡多糖可能通过TLR4信号通路发挥抗炎和免疫调节双重功效[24]；脂肪性肝炎则与AMPK等糖脂代谢、炎症相关通路密切关联[25]；CYP450作为一组混合功能氧化酶系，与药物、脂肪、酮体等内外源物质代谢有关，故其通路与药物性肝炎直接关联，柴胡可通过抑制大鼠肝内CYP450酶活性发挥保肝作用[26]。

除了与病因直接相关的信号通路，肝炎还涉及其他许多通路及环节，MAPK信号通路是细胞内主要的信号传导系统，细胞运用该系统将细胞外刺激信号传递到细胞核内[27]；FoxO家族为体内重要的转录因子，通过激活下游分子发挥复杂的调节作用[28]；PI3K/Akt信号通路具有调控细胞的增殖、分化、凋亡等功能[29]。肝病的发生发展存在“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”的规律，肝脏慢性炎症贯穿疾病始终。其中，p38 MAPK在炎症应答信号通路上起着关键性调控作用，并广泛参与到慢性肝病多个病程阶段[30,31]；JAK/STAT信号通路与人体对乙型肝炎病毒的细胞免疫相关，SSd可能通过抑制JAK2/STAT3通路减轻大鼠急性肝损伤[32，33]。肝纤维化进程与HSC活化直接相关，TGF-β1/p38MAPK信号通路将刺激信号传导至HSC，促使HSC活化、增殖与迁移[34]；乙型肝炎病毒核心前蛋白p22激活Wnt信号，使乙型肝炎向肝纤维化、甚至肝癌进展[35,36]。肝纤维化逐渐发展为肝硬化，导致肝细胞缺血缺氧，内环境的改变激活信号通路引起级联反应可导致抑癌基因表达下调、癌基因表达上调，转录因子HIF-1α参与了缺氧条件下人肝癌SMMC-7721细胞COX-2表达的调节，而SSd可能通过影响HIF-1α/COX-2信号通路发挥抗癌作用[37]；Hedgehog信号通路与肝癌发展亦存在复杂相互作用[38]；另外，JAK-STAT、NF-κB、Toll 样受体信号通路等与炎症相关的信号通路都与肝癌的发生、发展密切相关，实验证明柴胡皂苷b2抑制原发性肝癌可能与其调控STK4/IRAK1/NF-κB通路有关[39]。

本研究基于网络药理学分析柴胡抗肝炎的作用机制，肝炎发生发展涉及复杂的分子、通路，柴胡11个活性成分通过调控多条信号通路作用于91个靶点，共同发挥抗肝炎作用，体现柴胡多成分、多靶点、多途径的作用特点，网络药理学方法体现了中医药的整体观与系统性，为中医药治疗复杂疾病提供了新的思路和研究路径。