肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞与肝细胞癌的研究进展

童 乐 饶智国

1.武汉科技大学医学院 (湖北 武汉， 430061) 2.中部战区总医院肿瘤科

研究表明，肿瘤的发生和发展与肿瘤微环境密切相关[1]。近年来，炎症被强调为癌症的第7个标志，它建立了肿瘤细胞与肿瘤微环境(TME)之间的关系[2]。慢性炎症病史可能最终导致癌症和某些癌症的进展，如胃癌和宫颈癌。而在所有与肿瘤形成相关的慢性炎症的免疫细胞介质中，巨噬细胞起着至关重要的作用，是连接炎症和恶性细胞转化的“桥梁”。浸润在TME中的巨噬细胞统称为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)[3]。越来越多的证据表明，肿瘤细胞和巨噬细胞之间的串扰与肿瘤的进展有关。我国绝大多数的原发性肝癌归类于肝细胞癌(HCC)，占90%以上。本综述旨在探究TAMs与肝癌的发生、发展之间的相互关系，为肿瘤治疗提供新视角。

1 TME

TME是肿瘤存在的细胞环境。除了肿瘤细胞，TME还包括周围血管、细胞外基质(ECM)、其他非恶性细胞以及信号分子等[4]。通过使用细胞类型特异性标记物，研究人员已经鉴定了TME中不同类型的正常细胞，包括基质细胞、成纤维细胞、免疫细胞，以及周细胞、脂肪细胞。TME中的间质细胞和成纤维细胞可以分泌肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)和CXCL12趋化因子等生长因子，不仅可以促进恶性细胞的生长和存活，还可以作为趋化因子刺激其他细胞向TME内迁移[5]。这些细胞参与各种免疫反应和活动，如肿瘤为促进生存而策划的炎症反应。TME中最重要的免疫细胞是巨噬细胞。巨噬细胞具有多种功能，与癌症的发展和进展有关；它们促进肿瘤细胞逃逸到循环系统，抑制抗肿瘤免疫反应[6]。TAMs还可以增强、介导或拮抗辐射、细胞毒剂和检查点抑制剂的抗肿瘤活性。

TAMs在大多数人类和实验小鼠癌症中都很丰富，它们的作用通常是促肿瘤的[7]。TAMs是肿瘤间质中数量最多的炎症细胞群，占炎症细胞总数的30%～50%，其生物学特性与肿瘤的发生、发展等密切相关。且其表面装饰有广泛的质膜受体，能够识别表达在感染源、凋亡细胞表面的同源配体，或促进吞噬、激活、分化、迁移、黏附、生长和生存[8]。受体的识别伴随着表面的改变、摄取、信号和基因表达的改变，有助于动态平衡、宿主防御、先天效应机制和获得性免疫的诱导。

2 TAMs的分型

TAMs有2种活化形态[9]：①M1型，即经典活化的巨噬细胞；②M2型，即替代性活化的巨噬细胞。此外，根据接收到的刺激，巨噬细胞可分为M1、M2a、M2b和M2c[10，11]。M1 TAMs活化需要双信号[12]：人干扰素 γ(INF-γ)和外源性肿瘤坏死因子(TNF)或内源性TNF的诱导剂；M2 TAMs活化不需要双信号，但需要有合适的诱导剂，如白介素-4(IL-4)、IL-10、IL-13、糖皮质激素、维生素D3和转化生长因子-β(TGF-β)等。

M1 TAMs通过吞噬和细胞毒性有效识别和破坏癌细胞的抗肿瘤特性，主要功能包括分泌毒性中间体和多种炎症因子，激活Th1型细胞，杀伤吞噬的微生物和肿瘤细胞，并且通过表达大量主要组织相容性复合体Ⅱ类和B7分子来作为呈递抗原的重要细胞，参与Th1型免疫应答，具有促炎和抗肿瘤作用，M1巨噬细胞的增加表明肿瘤的恶性程度较低；而 M2 TAMs，通过分泌一系列细胞因子(如IL-10和TGF-β)来调节肿瘤生长及其血管生成、免疫逃逸、迁移和转移等，从而促进肿瘤进展，导致患者生存率降低[13-15]。

3 TAMs对肝脏肿瘤的影响

3.1 肝脏肿瘤微环境下的TAMs TME是围绕癌细胞的各种基质细胞的动态而复杂的环境。TME内的细胞相互作用，并与癌细胞相互作用，从而影响肿瘤的发展和进展。在这个过程中，它们会影响肝癌细胞的侵袭、肿瘤生长和转移[16]。

研究表明，TAMs通过在TME中产生大量细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶[17]，促进肿瘤的启动、血管生成、转移和抑制获得性免疫。TAMs在包括HCC在内的炎症相关癌症的发展过程中起着关键作用[18]。浸润的TAM与HCC患者预后不良有关[19]。据报道，M2 TAMs中的Wnt配体激活了肠上皮细胞中的Wnt信号。Wnt/β-catenin信号在肝脏发育、再生和癌症中起重要作用，Wnt配体和受体可由多种类型的肝细胞表达，如肝细胞和库普弗细胞(KCs)，它们就是一种组织驻留巨噬细胞[20]。上述研究表明，TAMs可以成为肝癌治疗的潜在靶点。

3.2 TAMs的极化 免疫细胞和基质细胞在细胞外空间的招募、成功激活和重新编程是癌细胞和TME相互作用的结果[21]。TAMs在肿瘤微环境中经历了被激素、细胞因子和凋亡细胞等不同细胞极化的复杂过程，这些过程干扰了免疫细胞。Mantovani等[22]提出TAMs暴露于IL-4和IL-10后，可形成交替激活的M2巨噬细胞，表现出更强的吞噬活性。与经典激活的M1 TAMs相比，这些细胞抗原提呈能力差，抑制T细胞增殖，抑制炎症，促进组织重塑和肿瘤进展。除细胞因子外，M1和M2型TAMs还表现出独特的趋化因子谱，例如，M1巨噬细胞表达1型细胞趋化因子(如CXCL9和CXCL10)，而M2 TAMs表达趋化因子CCL17、CCL22和CCL24。趋化因子也可以影响巨噬细胞极化[23]。

3.3 巨噬细胞的迁移 巨噬细胞是一种专业的迁移细胞，在免疫监视和正常组织发育中发挥着不同的作用。巨噬细胞从血液循环进入组织，黏附在血管壁上，穿过内皮细胞屏障，然后通过趋化作用向炎症部位迁移；巨噬细胞对创伤或炎症信号迅速作出反应，并迁移到炎症部位[24]；巨噬细胞对组织的趋化性是宿主对感染作出反应的重要步骤[25]。

3.4 TAMs的招募及功能 TAMs参与了肿瘤发展、血管生成、肿瘤生长和转移的各个方面。肿瘤细胞产生足够的促进肿瘤血管生成的信号，但在缺乏TAMs的情况下，肿瘤细胞的启动被推迟。在肿瘤微环境中，巨噬细胞被招募到低氧的肿瘤条件下，并促进血管生成相关转录因子的产生，如HIF-1和HIF-2。此外，巨噬细胞通过增加血管成熟度和血管通透性激活NF-JB信号通路，从而分泌血管内皮生长因子(VEGF)[26]。M1型巨噬细胞由干扰素γ、细菌脂多糖(LPS)刺激形成,能分泌IL-1、IL-6、IL-12和TNF等,表现出较高的抗原提呈功能,可激活免疫反应,保护机体免受感染,并杀伤肿瘤。M2型巨噬细胞可被IL-4、IL-10、IL-13和M-CSF/CSF-1等诱导形成,抗原提呈能力低,能分泌较高的IL-10和较低的IL-12,并能高表达清道夫受体(CD163)、甘露糖受体(CD206) 和半乳糖受体,具有抑制免疫应答,促进血管生成、 组织重构、创伤修复和肿瘤生成的作用。人们相信，TAMs通过IJB激酶b和NF-JB信号级联接收来自恶性细胞(如IL-1R和MyD88)的极化信号，从而维持其M2样表型[27]。实体瘤中M2巨噬细胞的存在相对高于M1巨噬细胞。TAMs数量的减少或偏向M1表型的增加使其能够破坏癌细胞或损害肿瘤的生长。

3.5 TAMs调节肝细胞癌的浸润及侵袭生长 肿瘤相关巨噬细胞可以调节肿瘤基质来加速肿瘤的侵袭、转移，在肿瘤发生早期，TAMs主要居于基底膜等部位，晚期巨噬细胞则居于肿瘤边沿，这个也预示肿瘤细胞可以加强巨噬细胞的基质调节能力促进肿瘤本身的发展，Jones等[24]的实验发现，肿瘤相关巨噬细胞是与肿瘤细胞一起运动的，TAMs主要存在于肿瘤周边或者肿瘤细胞与正常组织交界处。

实体瘤的特点是血管化不均匀和缺氧区，与治疗反应差、恶性进展、局部浸润和远处转移有关。缺氧促进肿瘤细胞和巨噬细胞的促血管生成程序，并允许TAMs在血管化较差的区域优先积聚。TAMs在缺氧中的适应是通过增加HIF-1和HIF-2诱导基因(例如VEGF、bFGF、CXCL8、糖酵解酶)的表达来实现的[27]。NLGP减少TME内的HIF1a，因此，VEGF减少了M1 TAM到M2的转换[28]。

肿瘤干细胞被招募到肿瘤部位是因为TME中有利的低氧条件[29]。癌症干细胞通常通过激活自我更新和干细胞相关通路与TME相互作用，如肿瘤干细胞可以通过促进缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子和促血管生成因子的产生而在低氧条件下存活。TME由浸润的内皮细胞、免疫细胞、信号分子和细胞外基质组成[30]。由于其免疫抑制能力，TME倾向于充当促进肿瘤发展和进展的治疗屏障[28]。使用LysM-cre小鼠诱导Hif1α或Hif2β的髓系特异性丢失，Cradini等[31]已经证实缺氧-HIF1通路在TAMs在实体瘤中的募集和激活中起主要作用，并且可能有助于TAM介导的血管生成和肿瘤转移。缺氧可以通过选择性上调趋化因子受体CXCR4的表达和诱导其配体CXCL12来影响肿瘤和间质细胞(包括TAMs)的定位和功能。

肿瘤在没有形成新血管(血管生成)的情况下，由于氧气供应和营养不足，扩张被限制在1～2 mm大小[32]。正负血管生成调节因子(血管生成开关)之间的不平衡最终导致原位肿瘤的进展，其中M2 TAMs是关键的效应因子。肿瘤浸润TAMs产生多种促血管生成因子，如TGF因子、VEGF、PDGF、促血管生成趋化因子等[33]，存在于许多肿瘤中。TAMs分泌血管生成因子胸苷磷酸化酶，从而在体外帮助促血管生成过程和促进内皮细胞迁移。TAMs还制备了几种血管生成调节酶，如MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-12和环氧合酶-2[34]。TAMs产生的几种趋化因子(CXCL1、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CCL2和CCL5)也有助于促进血管生成，因为它们对肿瘤组织中的血管生成开关有重要影响[35]。

有证据表明，CXCL5和CXCL8的水平与新生血管的增加有关，而新生血管的增加与宿主的存活呈负相关[36]。TAMS产生的CCL18与VEGF协同促进内皮细胞迁移和血管生成，因此是抗血管生成治疗的新靶点。

3.6 TAMs参与肿瘤逃逸的机制 癌细胞要发展成为一种潜在的致命和与临床相关的疾病，它们必须获得逃离上皮隔间并系统地侵入其他细胞空间的能力。这种逃逸需要肿瘤细胞降解基底膜，并将组织实质与上皮隔间分开。此外，在侵袭过程中，TME通过旁分泌和旁分泌相互作用部分影响和控制肿瘤生长[19]。在这种情况下，肿瘤相关的间质提供营养物质、氧气、酶和基质结合的生长因子，以促进肿瘤的进展和增殖[19]。研究表明，TME中的细胞相互作用影响癌症的发展。

Gorelik在20多年前指出TAMs促进肿瘤转移和逃逸[37]。Coffelt等[38]在多光子显微镜的帮助下，报告了TAM和肿瘤细胞在接近时经常迁移。TAMs释放的EGF与肿瘤细胞释放的CSF-1相互作用，促进肿瘤细胞迁移。TAMs以肿瘤坏死因子α依赖的方式，通过降解细胞外基质蛋白，通过基质金属蛋白-2(MMP-2)和MMP-9影响肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的侵袭。此外，Lynch等[39]研究表明，MMP-7依赖的转移促进作用是通过转化NF-κB配体受体激活剂(RANKL)来实现的。其他巨噬细胞衍生因子，如IL-1β、组织蛋白酶B、Wnt5a和信号素4D，也有促进肿瘤转移的报道。最近，有报道称巨噬细胞衍生的microRNA(MiRNA)也调节肿瘤的侵袭[40]。Versican通过激活促肿瘤巨噬细胞在肿瘤进展中起重要作用，其(一种大的硫酸软骨素蛋白多糖)在恶性肿瘤中的表达频率较高。

4 肿瘤信号通路对TAMs的影响

越来越多的证据表明，肿瘤细胞和巨噬细胞之间的串扰与肿瘤的进展有关。多种可溶性因子，如Wnts，对调节细胞与细胞间的相互作用起着重要作用。Wnt配体是一种分泌型蛋白，不仅参与胚胎发育过程中细胞的增殖、迁移和组织构型，还参与许多疾病，特别是肿瘤的发生[41]。一般情况下，Wnt配体可以分泌到由Wnless控制的细胞外环境中，然后以旁分泌/自分泌的方式与信号激活细胞上的Frizzled型受体结合，诱导典型的Wnt/β-catenin信号或非典型的Wnt/Ca～(2+)信号。Boulter等[42]已经发现巨噬细胞来源的Wnt3a对抗Notch信号来促进慢性肝病中肝祖细胞对肝细胞的特异性。因此，我们想知道肝肿瘤细胞来源的Wnt配体是否可以通过旁分泌方式在巨噬细胞中触发Wnt/β-catenin信号。Yang等[43]报道了Wnt/β-catenin信号在单核细胞向巨噬细胞分化和M2巨噬细胞中被激活。激活的Wnt/β-catenin信号促进M2巨噬细胞极化，从而诱导与Hepa1-6肝癌细胞共培养时TAMs的M2样表型。进一步研究表明，Wnt/β-catenin信号通过c-myc调控M2巨噬细胞极化。通过Wnless基因敲除阻断Hepa1-6细胞Wnt配体的分泌，在体外抑制M2巨噬细胞的极化，并通过重新编程肿瘤免疫微环境来减少体内肿瘤的生长。最后，在肝癌患者的活检组织中，也证实了M2巨噬细胞极化与TAMs中核β-catenin积聚的相关性。

5 肿瘤相关巨噬细胞与抗肿瘤治疗

TME仍然是宿主免疫系统和肿瘤之间的重要战场[44]。这种特殊环境中广泛的细胞相互作用将决定宿主对肿瘤的耐受性和反应。细胞肿瘤和分子免疫学的最新进展表明，肿瘤通过主动募集和调节各种细胞表型和功能来影响和影响TME[45]，目的是促进免疫抑制和对肿瘤相关抗原的耐受[46]。在某些情况下，肿瘤干细胞也通过产生抗炎细胞因子在TME内诱导免疫耐受[47]。因此，针对这些途径可以帮助管理不同类型的癌症，降低疾病复发的可能性。

一些研究已经证明，从海洋生物加勒比海鞘中提取的天然产物曲贝替定对人巨噬细胞和TAMs具有特定的细胞毒作用[48]。据报道，唑来膦酸联合索拉非尼等药理药物可以控制肿瘤微环境中巨噬细胞的数量并增强抗肿瘤作用[49]。其他几种药理药物据信可以阻断巨噬细胞的浸润并显示出抗肿瘤作用，包括沙利度胺、利诺米特、己酮可可碱和染料木素[50]。还有一种更好的潜在治疗方法可能是将M2 TAMs转化为M1 TAMs，以诱导促炎反应。此外，越来越多的报道显示巨噬细胞是向肿瘤微环境输送治疗诱导剂的关键介质。此外，一种植物来源的二萜类化合物(紫杉醇)刺激巨噬细胞表达高水平的NO、TNF-a和IL-1b，从而增强肿瘤细胞的细胞毒性，并恢复巨噬细胞产生IL-12[51]。据报道，一种能阻断PD-1/PD-L1通路的抗PD-L1抗体可以促进巨噬细胞介导的T细胞活化，并已进入临床试验[52]。

TAMs水平升高与预后不良有很强的相关性，提示巨噬细胞可作为癌症治疗的候选细胞。目前，巨噬细胞的募集被认为是诱导肿瘤进展、参与巨噬细胞浸润、血管生成以及将M2 TAMs转化为M1 TAMs以调节肿瘤活性的最关键步骤之一。