一株新分离的猪流行性腹泻病毒变异株的评估

方超，张智明，李建华，何世民

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是猪的一种以腹泻、呕吐、后期脱水以至死亡为临床症状，由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性、高度传染性肠道疾病。哺乳仔猪的死亡率高是本病的典型特征，死亡率可达到50%～100%，是危害养猪业的一种重要疾病[1-5]。2010年冬季以来，猪流行性腹泻出现变异株，导致PEDV CV777株疫苗免疫效果不理想，不能对免疫猪提供良好的保护，因此，开发猪流行性腹泻变异株疫苗有着十分迫切的现实意义[6-10]。

1 材 料

Vero细胞、MDBK细胞和PK-15细胞，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心传代保存；猪流行性腹泻ZF株F1代，由哈尔滨兽医研究所惠赠；DMEM细胞培养液，购自GIBCO公司；胎牛血清，购自CLARK公司；胰酶，购自GIBCO公司；PBS溶液，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心配制保存；中和抗体效价≥1∶32的猪流行性腹泻阳性血清，由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心制备、标定和保存；4～6周龄PEDV血清中和抗体阴性的断奶仔猪3头；牛病毒性腹泻病毒荧光抗体和猪瘟病毒荧光抗体，由哈尔滨兽医研究所惠赠；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 病毒培养和传代

2.1.1 细胞的复苏与传代

将冻存的Vero细胞从液氮中取出后，立即置于37℃水浴中快速融化。待细胞完全解冻后，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用吸管吸取新配置的细胞培养液，将沉淀轻轻悬起并分散均匀后转至含有10 mL细胞培养液的细胞培养瓶中，置37℃培养箱中培养36～48 h，观察细胞的生长情况，根据细胞的生长复苏状态，可在复苏后24 h进行1次换液。待细胞形成单层后弃去培养液，用无菌PBS溶液轻轻清洗细胞表面2次后，加入0.25%的胰酶短暂消化后弃去胰酶，用适量的细胞培养液轻轻吹打分散均匀，然后按照1∶3～1∶5比例进行传代，置37℃培养箱中培养。

2.1.2 PEDV的接种与收获

待细胞形成单层后，弃去培养液，用无菌PBS轻轻清洗表面2次后，按照2%的接种比例接种含有终浓度为10μg·mL-1胰酶的PEDV ZF株，置37℃培养箱中吸附1 h，期间每隔15 min轻轻晃动1次，最后补加含有终浓度为10μg·mL-1胰酶的无血清DMEM细胞培养液，同时设相同条件的不接毒Vero细胞作为空白对照，置37℃培养箱中培养48～72 h，逐日观察细胞病变（CPE）情况，待细胞病变达到80%以上时，收获培养物，-20℃冻融2次后，备用。按照相同的方法将PEDV ZF株从F1代连续继代15次，各代次病毒在收获后，均-20℃冻融2次后，备用。

2.1.3 病毒含量的测定

将细胞悬液按每孔100μL的量接入96孔细胞培养板，37℃、5%CO2条件下培养48～72 h，待细胞形成单层后，弃去细胞培养液，备用。将收获的病毒液用含有终浓度为10μg·mL-1胰酶的无血清DMEM细胞培养液进行10×的倍比稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μL。同时设正常细胞对照6孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养4～5 d，逐日观察细胞病变。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。正常细胞对照孔应不产生CPE。

2.2 病毒鉴定

2.2.1 血清学鉴定

将PEDV病毒液，按照2.1.3病毒含量的测定结果，用含终浓度为10μg·mL-1胰酶的DMEM无血清培养液稀释成200 TCID50/0.1 mL，分别与等量的猪流行性腹泻阳性血清、阴性血清混合，置37℃水浴作用1 h后，加入96孔细胞培养板中形成细胞单层的6个孔内，同时设正常细胞对照，置37℃、5%CO2培养箱中培养5 d，观察细胞是否出现病变。

2.2.2 分子生物学鉴定

引物的设计与合成。参照中华人民共和国国家标准《猪流行性腹泻病毒RT-PCR诊断技术》（GB/T 34757—2017）中的聚合酶链式反应进行引物合成及PCR检验，扩增315 bp长的片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物为5"-TAT⁃GGCTTGCATCACTCTTA-3"，下游引物为5"-TT⁃GACTGAACGAACCAACACG-3"，按照试剂盒提供的提取核酸的步骤进行操作，将上述提取的核酸进行RT-PCR扩增反应。反转录（20μL体系）：模板8.0 mL，通用引物1.0μL，5×Buffer 4.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，DTT 1.0μL，M-MLV 1.0μL，无RNA酶水3.0μL。反转录反应条件：将模板与反转录通用引物混合，置70℃水浴5 min，冰浴后迅速冷却，加入反转录体系的其他试剂，置42℃反转录1 h，然后再95℃终止反应，即得。PCR扩增反应体系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，灭菌去离子水17.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，52.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃终止循环。将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在电压5～10 V·cm-1条件下作用30 min，同时与DL 2000 DNA Marker进行比较，即可得出试验结果。

2.3 病毒的纯净性检测

根据《中国兽药典》（2015版，三部）的规定，疫苗的制备过程中需要对毒种的纯净性进行检验。检测的外源病毒主要包括牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVDV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖于呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒Ⅰ型（PCV-1）和Ⅱ型（PCV-2），其中BVDV、CSFV采用中国兽医药品监察所提供的间接免疫荧光法（IFA）进行检测，其余4种病毒使用PCR或RT-PCR方法进行检测。

2.3.1 间接免疫荧光法检测

取最后一次传代收获的PEDV病毒液，用猪流行性腹泻阳性血清中和后，分别接种已经形成单层的MDBK细胞和PK15细胞，37℃培养至少14 d（中间应至少传代1次），并设相应的细胞作为空白对照和BVDV阳性、CSFV阳性对照。最后一次传代的细胞单层培养5 d左右，按照BVDV、CSFV荧光抗体检测说明进行荧光抗体检查。

2.3.2 PCR或RT-PCR法检测

取2.2.2中提取的核酸进行PCR或RT-PCR检测。参照中华人民共和国国家标准《伪狂犬病诊断技术》（GB/T 18641—2002）中的聚合酶链式反应进行引物合成及PCR检验，扩增217 bp长的片段，上游引物为5"-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3"，下游引物为5"-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3"，退火温度56℃；参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程》（SN/T 1874—2007）中的聚合酶链式反应进行引物合成及PCR检验，扩增445 bp长的片段，上游引物为5"-CAGAATCAGCAACCTCAC-3"，下游引物为5"-TG⁃GTCTCTTCTGTGGTAGG-3"，退火温度为47.9℃；参照中华人民共和国国家标准《猪繁殖和呼吸综合征诊断方法》（GB/T 18090—2008）中的聚合酶链式反应进行引物合成及PCR检验，扩增372 bp长的片段，上游引物为5"-GCGGATCCATGCCAAATAA⁃CAAC-3"，下游引物为5"-AGCTCGAGTCATGCT⁃GAGGGTGA-3"，退火温度51℃；参照中华人民共和国国家标准《猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法》（GB/T 21674—2008）中的聚合酶链式反应进行引物合成及PCR检验，PCV-1型652 bp，PCV-2型1 154 bp长的片段，P1 5"-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3"，P2 5"-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3"，P3 5"-ACCCCCGCCACCGCTACC-3"，退火温度62℃。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.4 无菌检验与支原体检验

根据《中国兽药典》对病毒液进行无菌检验和支原体检验。

2.5 病毒的遗传稳定性测定

在疫苗的制备过程中，病毒的遗传稳定性非常重要，因此对PEDV进行了遗传稳定性检测。取2.1.2中连续培养传代的PEDV ZF株F6代、F11代和F16代病毒液，按照2.2.2中所述的核酸提取以及反转录方法进行核酸提取和反转录，对反转录的cDNA进行病毒的遗传稳定性分析。由于PEDV S蛋白是重要的免疫原性蛋白，因此选择S基因的部分序列进行。参照李衡[11]的研究结果合成扩增PEDV S部分基因的引物，上游引物为5"-GGTAAGTTGCTAGTGCG⁃TAA-3"，下游引物为5"-CAGGGTCATCACAATA⁃AAGAA-3"，目的片段大小为1 461 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR扩增反应体系（25μL）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1.0μL，灭菌去离子水17.0μL，DNA模板1.0μL，Taq酶0.5μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min；4℃终止循环。将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在电压5～10 V·cm-1条件下作用30 min，在凝胶成像系统下观察并切割目的片段，直接送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序的结果用DNA Stars软件进行分析。

2.6 病毒致病力的测定

取最后一次传代收获的PEDV病毒液，根据病毒含量测定的结果稀释到1×106.0TCID50·mL-1，备用，进行病毒致病力的测定。用4～6周龄的PEDV血清抗体阴性的断奶仔猪2头，每头猪经口服2.0 mL备好的PEDV病毒液。同时另设1头猪作为不接毒空白对照，相同条件隔离饲养。试验开始后观察14 d，每天就试验猪的精神状态、采食量、腹泻情况、死亡等临床症状进行观察和记录。

3 结果与分析

3.1 病毒培养和传代的结果

PEDV ZF株接种Vero细胞后，在24 h左右Vero细胞出现膨大、变圆等轻微的细胞病变，随着接毒时间的延长，病变逐渐明显，表现为细胞变圆、膨大、出现空泡以及细胞脱落，最终使得细胞单层裂解。待细胞病变达到80%及以上时，收获培养物；相同条件培养的对照细胞仅出现细胞颗粒增多等细胞老化的现象，结果见图1。

3.2 病毒含量的测定结果

将PEDV ZF株F1代在Vero细胞上连续传代15次，每个代次均进行病毒含量的测定，测定结果见表1。由表1可知，PEDV ZF株在连续传代的过程中，对细胞的适应性稳定，各个代次的病毒含量无明显差异。

图1 PEDV的细胞培养结果

表1 PEDV ZF株不同培养代次病毒含量测定结果

3.3 病毒鉴定

3.3.1 病毒的血清学鉴定结果

取最后一次传代收获的PEDV病毒液，进行病毒的血清学鉴定。结果表明该代次PEDV ZF株可被猪流行性腹泻病毒阳性血清完全中和，接种的Vero细胞观察5 d不产生细胞病变，病毒特异，结果见表2。

表2 血清学鉴定结果

3.3.2 病毒的RT-PCR鉴定结果

取最后一次传代收获的PEDV病毒液，进行PEDV的RT-PCR法鉴定，结果见图2。结果表明PCR能扩增出片段大小为315 bp左右的条带，与引物设计扩增目的条带的大小一致。

3.4 病毒的纯净性鉴定结果

3.4.1 间接免疫荧光法检测结果

取最后一次传代收获的PEDV病毒液，用猪流行性腹泻阳性血清中和后，分别接种已经形成单层的MDBK细胞和PK15细胞，进行外源病毒BVDV和CSFV的检测。结果表明，PEDV病毒液中BVDV、CSFV两种外源病毒检测结果均为阴性，结果见图3和图4。

图2 PEDV RT-PCR鉴定结果

图3 BVDV间接免疫荧光检测结果

图4 CSFV间接免疫荧光检测结果

3.4.2 PCR或RT-PCR法检测结果

取最后一次传代收获的PEDV病毒液提取的核酸，进行病毒液中PRV、PPV、PRRSV和PCV的PCR或RT-PCR检测。结果表明，在PEDV病毒液中，PRV、PPV、PRRSV和PCV的检测结果均为阴性，结果见图5。

图5 PEDV外源病毒检测结果

3.5 PEDV病毒液无菌检验及支原体检验结果

取最后一次传代收获的PEDV病毒液按照《中国兽药典》要求进行无菌检验及支原体检验。结果见表3和表4。结果表明PEDV病毒液没有被细菌、霉菌、支原体等污染。

3.6 病毒的遗传稳定性测定结果

分别取PEDV ZF株培养收获的F6代、F11代和F16代病毒液，进行PEDV S蛋白部分基因的扩增，结果见图6。

表3 无菌检验结果

表4 支原体检验结果

图6 PEDV S蛋白部分基因的扩增结果

将扩增的片段经胶回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果用DNA Star软件包MegAlign的Clustal W进行比对，结果PEDV ZF株F6代、F11代和F16代的S蛋白部分基因的同源性在99.8%以上，病毒的遗传稳定性良好。结果见图7。

图7 PEDV ZF株不同代次S蛋白部分基因序列比对结果

3.7 病毒致病力的测定结果

取最后一次传代收获的PEDV病毒液对4～6周龄的PEDV血清抗体阴性的断奶仔猪进行攻毒，进行病毒致病力的测定，并在攻读后每天对试验猪的精神状态、采食量、腹泻情况、死亡等临床症状进行观察和记录。结果攻毒的2头猪在24 h后出现轻微的腹泻、精神不振以及食欲减退等症状。随着时间的延长，攻毒的2头猪临床症状加重，出现水样腹泻、肛门及后肢粪便污染严重、四肢无力、站立不稳以及被毛粗糙、没有光泽等症状，7 d内有1头猪出现死亡，对死亡猪进行解剖，发现肠壁变薄、变透亮、出血，肠道内充满气体并含大量黄色内容物，见图8。未攻毒对照仔猪食欲正常，精神状态良好。

图8 攻毒猪剖检结果

4 结论

为了能更好地应对由PEDV变异株感染引起的猪流行性腹泻，本试验对已经分离鉴定的PEDV变异株进行细胞适应性、病毒含量、纯净性、遗传稳定性及致病力的检验，证明该毒株的细胞适应性好、病毒含量高、病毒纯净、遗传稳定以及致病力良好，可以作为制备预防PEDV变异株灭活疫苗的候选疫苗株，为后期疫苗的制备做好铺垫。