基于网络药理学探究当归补血汤治疗骨质疏松症的分子作用机制

陈华梅 黄枫 申震 林海雄 黄敏玲 李紫阁 李定 吴真 姜自伟

1. 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减低、骨组织微结构破坏，骨脆性增加，骨折风险增加为特征的全身系统性骨病[1]。随着年龄的增长，该病患病率越高[2]，已成为一种慢性多发常见病[3]，我国OP的总患病率为13 %[4]，2010年至2016年60岁以上人群OP总体患病率约为36 %[5]；对于OP的防治，西药大体有促进骨矿化药、抑制骨吸收药以及促进骨形成药[6]，但价格昂贵及不良反应[7-8]，部分人难以接受，而“简、便、廉、验”的中医治疗不失为一种选择。

当归补血汤首创于金代医家李东垣，由黄芪、当归组成，两药[10]皆为治疗OP常用药；研究[9]表明当归补血汤能改善小鼠红细胞功能，改善小鼠的骨髓抑制并且增强机体免疫功能[11]；此外还能保护心脑血管功能[12]、抗氧化[13]、抑制肿瘤细胞增殖[14]、改善骨小梁结构[15]、正向调节成骨细胞分化[16]。目前国内不乏对于当归补血汤有效成分的研究[17]，但机理仍未探清，基于此，本研究从网络药理学角度对当归补血汤治疗OP的分子机制进行探究，为临床提供导向。

1 材料和方法

1.1 当归补血汤有效成分、对应靶点及靶基因的获取

通过中药系统药理学技术平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)获取当归补血汤所有化学成分，根据OB>30 %、DL>0.18以及HL>4条件筛选出有效成分及对应靶点；通过Uniport数据库及NCBI数据库，限定物种为“人”，筛选出对应的靶基因。

1.2 OP对应靶基因获取

借助GeneCards(https://genealacart.genecards.org)数据库，以“Osteoporosis”为检索词，限定物种为“人”，检索OP的相关靶基因。

1.3 “有效化学成分-疾病靶点”网络图构建

将获取的有效化学成分对应靶基因与获取的OP相关靶基因通过生物信息学与进化基因组学网站绘制Venn图，整理有效化学成分-疾病靶点资料，运用Cytoscape 3.5.1软件中的“Network Analyzer”功能对资料进行分析，节点(node)有疾病、有效成分、有效成分-疾病共同靶基因，边(edge)代表组分之间联系, 并筛选出当归补血汤作用于OP的关键化合物。

1.4 PPI网络构建及关键靶点的筛选

将取得的交集基因导入STRING数据库(https://string-db.org/)中，限定物种为“Homo sapiens”，最低相互作用评分设置为“highest confidence(0.90)”，隐藏独立与其他蛋白无连接的蛋白，余参数保持默认设置，得到PPI网络互作图，再借助R软件统计分析得到所有蛋白邻接节点数目，统计分析排名前30的靶蛋白。

GO功能分析与KEGG通路富集分析借助R软件将取得的交集基因转化基因ID，进行基因功能、通路富集分析，设置条件P<0.05，限制物种为“人”，P值越小，富集越显著，排名越前，统计分析排名前20的基因功能与通路。

2 结果

2.1 有效成分、靶基因

筛选出有效化合物黄芪共15个(除去1个无靶点的化合物)，当归2个，总计17个，如下表1示；有效化合物对应靶基因共184个(重复基因只留1个)。

2.2 疾病靶基因

获取OP相关靶基因3 368个。

2.3 药物-疾病网络图

将步骤1.1中184个靶基因与步骤1.2中获取的3 368个靶基因取交集，如图1，得出130个交集基因。利用Cytoscape 3.5.1软件构建有效成分-疾病-靶点互作网络，如图2，共148个节点(node)，其中外圈绿色圆形为130个靶基因，内圈中三角形为17个有效化合物(其中紫色为黄芪的15个有效化合物；黄色为当归2个有效化合物)，两圈之间红色菱形为疾病，共423条边(edge)；根据MCC算法得出前7个关键化合物，其中当归2个，黄芪5个，如表2。

表1 当归补血汤候选化合物成分Table 1 Candidate compounds in DGBXD

图1 药物-疾病网络Venn图Fig.1 Venn diagram of drug-disease network

图2 中药有效成分-疾病-靶点网络图Fig.2 Network diagram of active component-disease-target of traditional Chinese medicine

表 2 当归补血汤治疗OP核心活性成分

2.4 PPI互作网络构建及靶蛋白筛选

将130交集靶基因导入STRING数据库，获得117个靶蛋白的互作网络，如图3(其中13个靶蛋白未发生相互作用)，共880条边，通过R软件统计分析出的排名前30的靶蛋白，如图4，其中靶蛋白主要有JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14、ESR1、MAPK8、FOS、CXCL8、VEGFA。

图3 当归补血汤治疗OP靶蛋白PPI网络Fig.3 OP target proteins PPI network treated with DGBXD

图4 排名前30的靶蛋白Fig.4 Top 30 target proteins

2.5 GO功能分析

通过R软件进行基因功能分析得出，130个交集基因涉及138个生物过程，P值越小，排名越前，统计分析前20生物功能如表3、图5、图6，主要涉及核受体活性、 配体转录因子活性、 调控序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性等功能，涉及氧化应激反应、细胞凋亡、炎性反应、白细胞粘附聚集生物过程。

图5 GO功能富集分析Fig.5 Analysis of GO function enrichment

图6 GO功能分析气泡图Fig.6 Bubble chart of GO function analysis

2.6 KEGG通路富集分析

共富集在149条生物信息通路(P<0.05)，排名前20通路如图7、图8，主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、乙型肝炎、前列腺癌、TNF信号通路等通路。

图7 KEGG富集通路分析Fig.7 Analysis of KEGG pathway enrichment

图8 KEGG通路气泡图Fig.8 Bubble chart of KEGG pathways

3 讨论

OP的发生被认为与活性氧(ROS)诱导的体内氧化应激极其密切[18]，不限于主流的观点由缺乏雌激素引起[19]；研究[20]表明增龄与氧化应激反应正相关，与抗氧化能力负相关，提示氧化应激与增龄性骨量减少关系密切；绝经后雌激素的缺乏，导致成骨细胞活性氧增加，抗氧化酶水平降低，氧化应激反应活跃，进而加快OP进程[21]，而激素疗法[22]作为防治OP方法，并不能明显改善OP症状。ROS作为氧化应激的关键因子，生理情况下，氧化-抗氧化处于动态平衡状态[19]；当机体处于氧化应激条件时，ROS可以通过联级反应抑制成骨细胞分化，诱导成骨细胞凋亡，降低成骨细胞功能[23]，使成骨效应滞后于破骨，进而引发OP。

从上述所获7个关键成分中，槲皮素具有强抗氧化作用[24,27]，能提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，此外还可发挥抗炎作用[24]；毛蕊异黄酮、芒柄花素可直接清除氧自由基[25]；山奈酚[26]能增加超氧化物歧化酶活性，消除氧自由基，降低ROS含量，从而减轻氧化应激造成的细胞凋亡；异鼠李素同样具有强氧自由基清除能力[27]；豆甾醇与β-谷甾醇有天然的氧自由基清除能力，能抑制PGE2表达发挥抗炎能力；β-谷甾醇还可发挥雌激素样作用[28], 而雌激素能够刺激成骨细胞且抑制破骨细胞的作用；研究[30-31]证明山奈酚有明显的雌激素作用，可以显著激活成骨细胞表面雌激素受体ER的活性，促进成骨，改善骨质疏松状态。雌激素缺乏、氧化应激条件下, ROS水平上升，可将Wnt/β-catenin信号通路中TCF/LEF转录转向FoxO转录达到消除ROS目的, 最终导致成骨减弱同时使成骨细胞OPG和RANKL表达失衡[32]，引起RANKL与特异性受体RANK结合, 激活JNK通路、ERK通路、Akt通路与作为下游的NF-κB通路[33]，诱导破骨细胞重要的转录因子如原癌基因c-fos等的表达, 促进破骨，阻止破骨细胞凋亡[32]，而槲皮素[27]、山奈酚[26]、异鼠李素[27]等降低ROS水平或起雌激素样作用，改善氧化应激状态，逆转骨代谢。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞介导胞内外刺激传导的信号通路，MAPK家族有三大成员，分别为ERK、JNK及p38 MAPK信号通路，其介导的自噬在调控破骨细胞分化中具有重要作用。喻琴云等[29]通过研究发现芒柄花素可抑制基质金属蛋白酶MMP-9表达, 可诱导P38MAPK发生磷酸化，并且认为后者经过信号级联放大的反应过程活化凋亡的途径, 导致破骨细胞发生凋亡，考虑与P38MAPK/ MMP-9信号通路有关。异鼠李素[34]能显著减轻过氧化物诱导的细胞DNA损伤和凋亡，经过各级反应进而参与ERK通路的激活，增强细胞抗氧化防御能力，揭示了异鼠李素诱导的细胞保护作用可能来自ERK信号通路的激活。有研究[43]表明PI3K/AKT/FoxO/NF-κB通路是调节细胞凋亡与氧化平衡的另一条重要通路，槲皮素可激活此通路促进成骨改善OP状态。槲皮素[35]能明显抑制TNF-α诱导内皮细胞表达ICAM-1和IL-6炎性蛋白，进而抑制炎症因子刺激破骨细胞的分化。而JUN家族蛋白中c-jun蛋白作为JNK通路的下游信号，在骨代谢非经典通路中，JNK通路可被激活，募集c-jun激活NF-κB通路进而抑制成骨蛋白表达，介导破骨细胞分化[36]；晁杲等[37]通过实验分析认为异鼠李素可通过抑制JNK的活化, 抑制NF-κB通路的活化, 抑制破骨细胞分化。李婧等[38]揭示异鼠李素对破骨前体细胞分化具有抑制作用的机制可能与NF-κB通路的抑制有关。Yang等[39]认为山奈酚和槲皮素可通过细胞外调节激酶(ERK)和雌激素受体通路增加Mg-63型成骨细胞样细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，并认为山奈酚是一种有效的抗破骨剂。OP往往作为糖尿病并发症存在[40]，在AGE-RAGE信号通路中，AGEs是一种糖基化终产物，能结合RAGE引起氧化应激反应引发OP；前者还可上调RAGE的表达，通过Wnt/β-catenin 通路交叉作用抑制成骨分化[41]；刘贵波等[42]研究证实山奈酚可以抑制AGEs诱发RAGE的表达，从而可间接地抑制OP发生。

综上，本研究显示当归补血汤能通过多成分、多靶点、多通路作用于OP，可能与其发挥抗氧化作用和雌激素样作用有关，可为下一步实验验证提供理论基础。