基于WNT16预防骨质疏松非椎体骨折的研究进展

陈天鹏 何才剑 房谋昊 周航 唐彬彬 刘康 梁博程 毛应德龙 郄凤卿 史晓林*

1.浙江中医药大学第二临床医学院，浙江 杭州 310000 2.浙江省新华医院，浙江 杭州 310000 3.东京癒心健康研究所，日本 东京

骨质疏松患者由于其骨量减少，骨微结构破坏，骨脆性增加而导致骨折风险大大升高[1]。在50岁以后的骨质疏松患者中，每过10年骨折的概率就增加1倍[2]。骨质疏松骨折主要发生于髋部、椎体、桡骨远端、肱骨[3]。目前，关于骨质疏松椎体骨折的研究取得了重大进展，而非椎体骨折的研究进展相对落后[4]。但就骨质疏松患者骨折的发病概率、死亡率，和给患者造成的经济损失和痛苦而言，非椎体骨折远远高于椎体骨折，其中尤其是髋部骨折更为显著[5]。现在临床上使用的抗骨质疏松药物，对非椎体骨折风险的预防作用也往往弱于椎体骨折[6]。椎体骨折主要是因为松质骨含量减少，而非椎体骨折主要原因以皮质骨变薄或变脆引起的[7]。基于这些差异，我们推测，抗骨质疏松药物在皮质骨和松质骨作用可能不一致。皮质骨和松质骨在调节骨稳态所涉及的信号通路可能有所差别。关于Pyle综合症的研究证实了这种猜测，在Pyle综合症患者中，干骺端骨小梁均匀但骨干部皮质骨明显减少[8]。

1 WNT信号通路对骨质疏松的影响

WNT信号通路在骨稳态调节中起着至关重要的作用[9]。在经典WNT信号通路中，WNT配体通过激活β-catenin信号，诱导转录因子osterix的表达，从而促进骨形成。与此同时，该信号增加了骨保护素(OPG)的形成，抑制骨吸收[10]。在非经典WNT信号通路中，WNT5a通过钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶II-TGF-β激活的激酶1-Nemo样激酶信号转导抑制了共阻遏物复合物的Ppar-γ反式激活，并诱导了Runx2的表达，从而促进了成骨细胞生成[11]。最近一项研究中发现了一种独立于β-catenin信号的另一非经典WNT信号通路 ——WNT16。WNT16是家族中的一员，主要表达在皮质骨和骨膜中[12]。研究发现，成骨细胞分泌的WNT16能直接作用于破骨细胞的RANK受体，干扰RANKL与RANK受体的结合而抑制破骨细胞分化。另一方面，WNT16通过促进成骨细胞骨保护素的生成，竞争性抑制RANKL与RANK受体的结合而抑制皮质骨上的骨吸收[13]。

注：WNT16可抑制破骨细胞Rank受体表达及干扰Rank受体与Rankl的结合，抑制破骨细胞分化成熟。WNT16还能通过OPG的表达间接的抑制破骨细胞分化。图1 WNT信号通路对骨质疏松的影响Fig.1 The influence of Wnt signaling pathway on osteoporosis

2 WNT16增加皮质骨强度

皮质骨的脆性增加是造成骨质疏松性非椎骨骨折的主要因素，但对皮质厚度与密度的调控机制知之甚少[14]。在Ohlsson等[15]对WNT16失活小鼠模型的研究中表明，WNT16失活小鼠对比对照组小鼠，骨皮质厚度明显下降(P>0.05)。皮质骨厚度减少是由骨吸收增加和骨膜减少形成所致。这表明，WNT16是在骨皮质生长发育中的关键调节因子，是皮质骨厚度和非椎体骨折的主要决定因素。因此，WNT16可能成为预防骨质疏松非椎体骨折的关键靶点。针对WNT16这一预防骨质疏松非椎体骨折的潜在靶点，通过他莫昔芬诱导小鼠WNT16高表达的实验中进一步验证了WNT16在骨稳态中所起的作用。他们发现，在他莫昔芬诱导WNT16高表达的小鼠中，骨膜形成增加，骨皮质明显增厚，但骨小梁的数量并不增加[16]。这表明，他莫昔芬调节的WNT16可能主要发生在皮质骨。在此项实验中还发现，在小鼠的股骨皮质骨中WNT16mRNA表达水平明显升高。这一发现，更加证实了WNT16调控骨量的场所在骨皮质。在这一项研究[16]中也解释了这一现象，研究者整体上删除了WNT16基因，小鼠的皮质非常薄，而长骨和椎骨中的小梁却正常。WNT16在旁作用于皮质骨中的破骨细胞祖细胞，并对破骨细胞的形成产生负调节作用，从而导致皮质骨而不是小梁骨增加。因此，我们可以推测，WNT16作用于骨皮质，在预防骨皮质丢失中有积极作用，可能成为预防骨质疏松非椎体骨折的靶点及药物开发提供研究方向。

3 WNT16对糖皮质激素性骨质疏松(GIOP)小鼠骨皮质影响

糖皮质激素(GC)由于其良好的抗炎、免疫抑制作用，广泛地应用于临床，与此同时，由糖皮质激素引起的骨质疏松及骨折风险也大大增加[17]。GC降低皮质骨含量和厚度，是骨质疏松非椎体骨折的危险因素之一。在先前的研究中发现，GC通过减少各种信号成分，如 β-catenin蛋白来抑制经典WNT信号通路。另外，GC还能促进WNT抑制剂的产生从而抑制WNT信号[18]。这表明，GC诱导的骨质疏松与WNT信号通路密切相关。WNT16作为WNT家族中的一员，与皮质骨骨量与非椎体骨折密切相关[19]。因此，我们推测GC同样能抑制WNT16而导致骨皮质骨减少和骨折风险增加。Hildebrandt 等[20]在使用泼尼松龙对成骨细胞作用中发现，泼尼松龙明显抑制了WNT16在成骨细胞中的表达。为测试WNT16能否逆转成骨细胞功能，在接下来的实验中，他们往泼尼松龙成骨细胞组中加入了重组WNT16，最后测试成骨细胞骨形成功能得以恢复。这一发现表明WNT16可能是逆转GIOP的关键靶标。但不足的是，本研究仅在细胞层面上表明WNT16能解除GC抑制成骨细胞功能，而在缺乏WNT16在表型上对GIOP的影响。在 Ohlsson等[21]一项研究中弥补了这一不足，他们比较了GC对野生型大鼠和WNT16过表达的转基因鼠的骨密度发现，WNT16过表达的大鼠BMD显著高于野生小鼠。这表明WNT16在表型上能拮抗GC导致的骨量流失而预防骨折风险。值得疑惑的是，此项实验GC降低了野生型WNT16mRNA的表达，但对WNT16过表达的转基因小鼠WNT16mRNA水平却没有影响。在另一项研究中得出了一个与此完全相反的结论，即WNT16的过表达并不能保护GC导致的骨量流失及增加的骨折风险。Alam等[22]研究发现，GC都显著降低了野生型和WNT16过表达转基因小鼠的骨密度，骨形成标志物以及WNT16mRNA水平，虽然WNT16过表达转基因小鼠骨密度，PIN1水平高于野生型，但这种差异可能是由基线水平、组间差异造成的，而且这种差异也不足以完全抵消GC造成的骨量流失和骨折风险。但可以明确的是，WNT16对GC小鼠的骨形成、骨量增加有积极作用，但是否能完全抵抗GC诱导的骨量丢失尚有争议，值得进一步研究。

4 WNT16对去卵巢大鼠骨皮质影响

绝经后老年女性是骨质疏松症高发人群，对于她们来说，骨折是毁灭性的打击[23]。在Mitek等[24]研究了绝经后骨质疏松妇女的基因易感性中发现，在这类人群中，WNT16 rs2908004基因变异的的多态性存在显著差异。其中，骨折风险大的人群中这一差异更为显著。因此，我们推测WNT16与绝经后骨质疏松人群的骨折相关。在先前的研究[25]中，已证实雌激素能增加绝经后骨质疏松患者的骨密度和降低其骨折风险。雌激素主要通过抑制破骨细胞分化来增加骨小梁和抑制皮质内骨吸收[25]。但其具体分子机制还不清楚。Almeida等[26]与Sims等[27]两项对雌激素与WNT16相关性研究中，他们分别使用雌二醇和他莫西芬作用于成骨细胞，实验结果表明，两种雌激素类似物干预后WNT16的表达都有所上升。结果似乎表明了雌激素对预防骨折的风险是通过WNT16介导的。在他莫西芬处理WNT16高表达，雌激素受体缺失的小鼠中，骨皮质是雌激素受体缺失野生小鼠的十几倍，这表明WNT16能弥补雌激素受体缺失导致的骨量流失。这似乎更加支持了雌激素对WNT16的直接调节。但在Movérare-Skrtic等[28]的研究中却表明雌激素和WNT16的保骨作用是独立的。WNT16高表达的转基因小鼠在摘除卵巢后，骨密度降低至与卵巢摘除的野生型小鼠一致。而且，在雌激素干预WNT16缺失的转基因小鼠的实验中，仍然能提高小鼠骨强度。尽管雌激素保骨作用是否与WNT16相关还具有争议，但是WNT16在卵巢摘除小鼠中，增加骨皮质、预防骨折风险却是明确的[29]。综上所述，WNT16可能成为预防绝经后骨质疏松骨折的潜在靶标。

5 年龄和性别对WNT16的影响

众所周知，年龄和性别是骨质疏松和骨折其中重要的影响因素[30]。在上文中论述了WNT16在GIOP和绝经后骨质疏松患者的骨稳态中起着至关重要的作用，但是缺乏了年龄和性别对WNT16的影响。Shen等[31]在性别和年龄对人骨髓基质细胞WNT基因表达的研究中，仅发现WNT16在性别中存在明显差异，且男性表达高于女性。而WNT16在不同年龄的大鼠中表达水平却没有发现差异。而在Todd 等[29]研究中发现，不管是雌性或雄性鼠，WNT16在骨皮质中的表达随年龄升高而降低，而在肾脏中表达却没有随年龄而变化。因此，我们推测上述两项实验结果的差异可能源于检测组织的不同。我们知道，WNT16主要表达在皮质骨和骨膜，所以我们倾向于后者得出的结论，即WNT16的表达随年龄增长而降低。这揭示了为什么老年人骨质疏松患病率高和骨折风险大的又一内在原因。WNT16可能为老年性骨质疏松提供研究方向。

6 总结与展望

WNT16在调控骨皮质厚度与骨小梁密度起着至关重要的作用，由于它主要表达在皮质骨和骨膜，因此，WNT16在预防非椎体骨折的作用可能更加重要。在上述的论述中，WNT16对老年、绝经后、糖皮质激素所造成的骨质疏松和非椎体骨折均有一定作用。因此，WNT16可能成为预防各种类型骨质疏松，以及骨质疏松非椎体骨折的关键靶标，从而为骨质疏松非椎体骨折临床研究，药物设计提供一个有价值的新方向。近期，关于一种WNT脂肪酶——notum的研究中发现，这种脂肪酶能够明显抑制WNT信号通路，从而使骨皮质显著丢失[32]。在通过对notum抑制的研究中发现，notum抑制能明显增加骨皮质厚度[33]。因此，notum可能成为预防骨质疏松非椎体骨折的又一潜在标靶。只是，现阶段关于notum的基础研究尚少，notum与降低骨质疏松风险的关联存疑，值得进一步深入研究。