混合盐胁迫对急性子萌发生理活性的影响

邵玫钰 孙静漪 王辉 吴越程 季天智 陈灿宇 袁强 睢宁

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

急性子为凤仙花科植物凤仙花（Impatiens balsamina L.）的干燥成熟种子，具有破血、软坚、消积的作用，临床上多用于癥瘕痞块、经闭、噎膈等症[1]。现代临床治疗食管癌吞咽困难常以芍药甘草汤为主方，其中正是以威灵仙、急性子等软坚散结[2]。凤仙花为常见的园林花卉，在我国各地庭院广泛栽培，急性子具有较强的土壤适应性和抗逆性，栽培管理方便[3-4]，但目前土壤盐碱化现象日益严重，对植物生长造成较严重的影响。本研究探讨不同混合盐胁迫对急性子种子萌发生理活性的影响，确定急性子能够生长的盐浓度，为急性子在盐碱土壤中栽培提供理论依据。

种子是植物体中含水量最低的器官，为种子提供水分是植物生长的第一步，种子萌发过程中的水分情况、生理生化指标与其生命征象密切相关[5]。混合盐对植物有水分胁迫和离子毒性，而水分胁迫与种子萌发过程中的呼吸作用也有密切关系[6]，从而影响种子萌发。种子是种子植物所特有的延存器官，急性子为凤仙花的干燥成熟种子，了解急性子萌发过程中的生理生化变化，就能更好地提高其萌发率和田间出苗整齐度[7]。

盐类是植物生长代谢过程中的必需物质，但是过量的盐分会改变细胞的渗透势，影响植物对水分的吸收，从而造成植物体的生理干旱，降低植物生物量的积累[8]。盐胁迫是影响种子生长、降低产量的主要环境问题之一[5]，因此本实验以急性子为研究对象，考察不同浓度混合盐胁迫对种子萌发生理活性的影响，阐明急性子的耐盐机制，为今后急性子栽培的土壤选择、范围扩展以及科学栽培提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂 急性子为凤仙花科植物凤仙花（Impatiens balsamina L.）的干燥成熟种子，购于浙江磐安。无水乙醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司（批号：20160414）；硫酸购于西陇科学股份有限公司（批号：1610091）；葡萄糖购于上海强顺化学试剂有限公司（批号：20141211）；间苯二酚购于上海麦克林生化科技有限公司（批号：C10102717）；牛血清蛋白购于浙江天杭生物科技股份有限公司 （批号：20161207）；蒽酮购于上海展云化工有限公司（批号：160115）；四唑氮蓝购于杭州昊天生物技术有限公司（批号：3068B512）； 植 物丙二醛 （malondialdehyde，MDA）检测试剂盒购于南京建成生物工程所（批号：20171103）。

1.2 主要仪器 AR224CN电子天平购于奥豪斯仪器（上海）有限公司；KQ2200DA型数控超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司；Synergy H1多功能酶标仪为美国博腾公司产品；Spectrumlab 22PC紫外分光光度计为上海棱光技术有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 种子处理及发芽 采用培养皿发芽法。挑选大小相近、饱满、无虫蛀的急性子，次氯酸钠消毒后，播种于垫有2层定性滤纸的培养皿中，设置不同的浓度梯度，每个浓度梯度100粒种子，3次重复。氯化钠、硫酸钠、碳酸氢钠3种盐等摩尔混合，根据添加混合盐的量不同，设置对照组（0%）、轻度组（0.3%）、中度组（0.6%）、重度组（0.9%）分别进行盐胁迫处理。将培养皿放入组培室，在25℃、80%湿度条件下发芽12d，期间每天观察并记录急性子的萌发情况，并计算发芽率、发芽势、发芽指数等指标。相关指标的计算公式如下：发芽率（%）=（正常发芽的种子数/供试种子总数）×100%；相对发芽率（%）=（处理组发芽率/对照组发芽率）×100%；发芽势 （%）=（第6天正常发芽种子数/供试种子总数）×100%；发芽指数（Gi）=∑Gt/Dt，式中Gt为不同培养时间（t）的发芽种子数，Dt为相应的培养时间；相对盐害率（%）=（对照组发芽率-处理组发芽率）/对照组发芽率×100%。

1.3.2 急性子生理生化指标的测定 称取籽粒饱满、无病虫害的目标种子5g，进行消毒灭菌处理后，分别放入对照组、轻度组、中度组和重度组盐溶液中，置于25℃的培养箱，拍照并记录第0、2、4、6、8天种子萌发的形态变化，测量其含水量，参照《植物生理学实验》的方法测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性[9]145、超氧化物的方法歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）活性[9]142，采用羟胺氧化法测定超氧阴离子产生速率[9]137，用植物MDA检测试剂盒测定MDA含量，采用双缩脲法测定可溶性蛋白含量，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[10]。

1.4 统计学分析 运用Microsoft Excel进行计算及绘图，采用 SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。计量资料若符合正态分布且满足方差齐性，以±s表示。多组间均数比较采用两因素方差分析，组间两两比较采用邓肯新复极差法（sum of squares due to regression，SSR）法。各组指标的相关性采用Pearson简单相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组急性子发芽情况比较 混合盐处理对急性子发芽的影响显著，其中中度、重度盐处理与对照处理相比，显著降低急性子的发芽率、发芽势、发芽指数（P＜0.01），且显著提高相对盐害率（P＜0.01）；轻度盐处理相较对照组，仅显著减低发芽势和发芽指数（P＜0.01），对发芽率和相对盐害率影响不显著（P＞0.05）。不同盐处理之间比较，发芽率和相对盐害率差异达到极显著水平（P＜0.01），随着盐害水平的增加，发芽率显著降低，相对盐害率显著提高。在发芽指数方面，中度组和重度组与轻度组相比，降低程度分别达到显著（P＜0.05）和极显著水平（P＜0.01）。 不同盐分处理之间比较，发芽势差异无统计学意义（P＞0.05）。由此可见轻度混合盐对急性子萌发无显著影响，高浓度混合盐的相对盐害率高达97.30%，对急性子萌发有明显的抑制作用，且随着浓度的增高，对种子萌发抑制作用增强。见表1。

表1 不同混合盐处理下急性子发芽情况比较Tab.1 Comparison of seeds of Impatientis balsamina L.germination under different mixed salt concentration treatments

2.2 各组急性子总芽长比较 混合盐处理对急性子总芽长影响显著，除第2天的轻度组与对照组比较总芽长降低显著（P＜0.05），其他各处理组与相同时点对照组相比，总芽长降低极显著（P＜0.01）。同一时点内，各组间总体比较差异极显著（P＜0.01），但轻、中、重度组盐分处理两两比较，除第6天外，总芽长无显著性差异（P＞0.05）。第6天时，中度组、重度组与轻度组相比，总芽长显著降低（P＜0.05）。同一组内，随着处理时间的延长，总芽长显著增加（P＜0.01）。可见混合盐对急性子总芽长有一定抑制作用。见表2。

表2 不同混合盐处理下急性子总芽长比较（±s，cm）Tab.2 Comparison of the total bud length of Impatientis balsamina L..under different mixed salt concentration treatments（±s，cm）

表2 不同混合盐处理下急性子总芽长比较（±s，cm）Tab.2 Comparison of the total bud length of Impatientis balsamina L..under different mixed salt concentration treatments（±s，cm）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与轻度组比较，#P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05，**P＜0.01； compared with mild group，#P＜0.05

总芽长F值 P值第2天 第4天 第6天 第8天对照组 0.417±0.029 3.067±0.764 8.133±0.551 9.067±2.768 28.652 ＜0.01轻度组 0.367±0.029* 1.067±0.252** 1.367±0.252** 2.800±0.229** 80.170 ＜0.01中度组 0.317±0.029** 0.683±0.029** 0.600±0.050**# 0.883±0.257** 10.656 ＜0.01重度组 0.317±0.029** 0.483±0.029** 0.550±0.087**# 0.433±0.029** 13.094 ＜0.01 F值 11.000 31.149 434.324 24.129 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01组别

2.3 各组急性子萌发过程含水量比较 种子萌发过程中含水量的变化反映了种子的吸水能力。混合盐处理对急性子含水量影响显著（P＜0.01）。第2天时，中度组和重度组与对照组相比，降低程度分别达到显著（P＜0.05）和极显著水平（P＜0.01），但轻度组与对照组相比，没有统计学差异（P＞0.05）。此后几天，各处理组与对照组相比，降低程度均达到极显著性水平（P＜0.01）；其中第8天时，中度组、重度组与轻度组相比，也显著降低（P＜0.01），但中、重度组之间无统计学差异（P＞0.05）。而随着处理时间的延长，急性子萌发过程中含水量不断升高，除重度组外，其余各组含水量随着时间延长均显著增加（P＜0.01）。萌发第8天时，对照组急性子含水量接近90%，而中、重度组种子含水量仍然只有40%～50%。萌发过程中对照组处理平均含水量为61.19%，中、重度组平均含水量分别为44.27%、42.48%，可见高浓度对急性子吸水能力有显著抑制作用。见表3。

表3 各组急性子萌发过程中的含水量比较（%）Tab.3 Comparison of water content during Impatientis balsamina L.germination in each group（%）

2.4 各组急性子POD活性比较 混合盐处理对急性子POD活性的影响显著，不同浓度混合盐处理下急性子POD活性总体呈现上升的趋势。第4、8天盐浓度各处理组间POD活性差异显著（P＜0.05），第6天POD活性差异极显著（P＜0.01）。不同处理时间比较，同一组内POD活性呈降低趋势，其中对照组差异有统计学意义 （P＜0.01），其余各组差异均无统计学意义 （P＞0.05）。见表4。对照组与轻度组萌发过程中平均POD活性分别为0.060U·g-1和0.056U·g-1，差异无统计学意义（P＞0.05）；而重度组平均POD活性最高，为0.115U·g-1，与对照组相比升高了0.055U·g-1。由此可见，低浓度对急性子POD活性影响不显著，高浓度混合盐显著升高急性子POD活性。

表4 各组急性子POD活性比较（U·g-1）Tab.4 Comparison of Impatientis balsamina L.POD activity in each group（U·g-1）

2.5 各组急性子SOD活性比较 不同浓度混合盐胁迫下，SOD活性总体呈上升趋势，但总体比较混合盐浓度对急性子SOD活性影响不显著（P＞0.05）。但第4天时，中度组与对照组比较，SOD活性显著升高（P＜0.05）；第6、8天中，与对照组比较，重度组SOD活性也显著升高（P＜0.05）；轻度组与对照组比较均无统计学差异（P＞0.05）。但随着处理时间延长，各组SOD活性变化不显著（P＞0.05）。见表5。萌发过程中平均SOD活性水平最低的是对照组，为132.169U·g-1；而0.9%浓度处理组平均SOD活性可达144.685U·g-1。由此可见，高浓度对急性子SOD活性有升高作用。

表5 各组急性子SOD活性比较（U·g-1）Tab.5 Comparison of Impatientis balsamina L.SOD activity in each group（U·g-1）

2.6 各组急性子MDA含量比较 混合盐处理对急性子MDA含量的影响不显著（P＞0.05）。相同处理时间内，与对照组比较，各处理组急性子MDA含量升高不显著（P＞0.05）。随着时间的延长，各组急性子MDA含量呈现连续下降趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。 见表6。

表6 各组急性子MDA含量比较（nmol·g-1）Tab.6 Comparison of Impatientis balsamina L.MDA activity in each group（nmol·g-1）

2.7 各组急性子超氧阴离子产生速率比较 不同浓度混合盐胁迫下，只有第8天时多组间总体比较急性子超氧阴离子产生速率变化差异极显著（P＜0.01）。第8天时，与对照组比较，中、重度组超氧阴离子产生速率显著升高（P＜0.01），但轻度组变化不显著（P＞0.05）。而随着时间的延长，对照组和轻度组急性子超氧阴离子产生速率大体呈下降的趋势。随着时间的延长，对照组急性子超氧阴离子产生速率总体呈现下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）；其他各处理组急性子超氧阴离子产生速率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表7。随着混合盐浓度增加，萌发过程中平均超氧阴离子产生速率增加。对照组平均超氧阴离子产生速率处于较低水平，为137.05μmol/（g·h）；而重度组平均超氧阴离子产生速率值可达219.13μmol/（g·h），由此可见高浓盐胁迫会促进超氧阴离子产生。

表7 各组急性子超氧阴离子产生速率比较［μmol/（g·h）］Tab.7 Comparison of the rate of O2-production in each group［μmol/（g·h）］

2.8 各组急性子可溶性蛋白含量比较 混合盐处理对急性子可溶性蛋白含量影响显著。相同处理时点，中度组、重度组与对照组比较，急性子可溶性蛋白含量变化显著，其中第2天时，变化差异极显著（P＜0.01），第4天时，变化差异分别为显著（P＜0.05）和极显著（P<0.01）；轻度组与对照组比较，只有第8天显著降低（P＜0.05），其他时间点变化均不显著（P＞0.05）。而不同盐分处理之间，中、重度组与轻度组相比，变化程度大多达到极显著水平（P＜0.01）和显著水平（P＜0.05）。各组急性子可溶性蛋白的含量随着时间延长显著下降（P＜0.01）。见表8。由此可见，低浓度混合盐处理对急性子可溶性蛋白含量无明显影响，但高浓度组对其有一定胁迫作用。

表8 各组急性子可溶性蛋白含量比较（μg·g-1）Tab.8 Comparison of soluble protein content in each group（μg·g-1）

2.9 各组急性子可溶性糖含量比较 混合盐处理对急性子可溶性糖含量的无显著影响。随着混合盐浓度升高，萌发过程中可溶性糖含量呈降低趋势，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。但第4天时，重度组急性子可溶性糖含量与对照组、轻度组、中度组比较显著降低（P＜0.05）。随着时间的延长，急性子可溶性糖含量大致呈上升趋势，其中对照组随不同时间变化差异显著（P＜0.05），重度组随不同时间变化差异极显著（P＜0.01）。见表9。对照组萌发过程中平均可溶性糖含量最高，达0.047μg·g-1；重度组平均可溶性糖含量最低，为0.041μg·g-1，由此可见，混合盐对急性子可溶性糖含量有一定抑制作用。

表9 各组急性子可溶性糖含量比较（μg·g-1）Tab.9 Comparison of soluble sugar content in each group（μg·g-1）

2.10 各组急性子指标相关性分析 对各组指标的平均值进行变量间简单相关分析。盐浓度与含水量（r=-0.9660）呈负相关（P＜0.05）；与SOD活性（r=0.9735）、超氧阴离子产生速率（r=0.9806）呈正相关（P＜0.05）。盐浓度与发芽率（r=-0.9466）、总芽长（r=-0.8722）、可溶性蛋白（r=-0.4531）、可溶性糖（r=-0.9322）呈负相关，但相关性不显著（P＞0.05）；与POD活性（r=0.9026）、MDA含量（r=0.8776）呈正相关，但相关性不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 不同浓度混合盐胁迫对种子萌发的影响 种子萌发阶段的耐盐状况在一定程度上反映了植物的耐盐程度，可以作为耐盐植物早期选择与评价的指标[11]。种子萌发期是其耐盐能力相对较弱的时期，盐胁迫可减少种子水分吸收，从而降低细胞渗透性，改变种子新陈代谢能力[12]。综合不同混合盐胁迫下急性子的发芽率、发芽势、发芽指数、相对盐害率，结果表明混合盐浓度对急性子正常萌发有显著影响，随着盐浓度升高，急性子发芽活性受到抑制，含水量持续降低。在高盐浓度（0.9%）条件下，种子的发芽速率明显减慢，含水量下降，由此可知盐浓度可以影响植物细胞渗透调节，混合盐浓度较高会阻碍细胞吸水，破坏细胞膜的结构，使细胞无法进行渗透调节，从而导致细胞正常生命活动受到阻碍，吸水能力下降，种子难以发芽[13]。

高浓度混合盐抑制急性子的萌发，降低其发芽率；轻度盐胁迫下的急性子发芽率与对照组比较差异无统计学意义，但是发芽指数却显著低于对照组，同时其总芽长也显著降低，可能因为轻度混合盐溶液有杀菌消毒作用，有利于急性子萌发，但对种子活性没有促进作用。随着混合盐浓度增加，对种子萌发的抑制作用逐渐加强，浓度越高，萌发时间越久，生长速度越缓慢，相对盐害率越大；当盐浓度达0.9%时，盐害率高达97.30%。由此可见，急性子具有一定耐盐性，混合盐浓度在一定范围内（＜0.3%），急性子可以正常发芽。

3.2 不同浓度混合盐胁迫对种子生理生化指标的影响 植物体内抗氧化酶系统包括POD、SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT），可以保护细胞膜，使其免受活性氧（reactive oxygen species，ROS）或其他过氧化物自由基的伤害。POD具有很强的活性，可以有效清除细胞内的过氧化氢，起到保护植物细胞的作用[14]。SOD与质膜损伤造成的种子劣变及种子耐贮性下降有密切关系，能够防止种子劣变，提高种子抗性[15]。MDA是种子氧化应激反应过程中的产物，影响着种子的质量[16]，能够间接反映细胞损伤程度。可溶性蛋白为种子的发育及生长提供养料和能量，调控着种子的代谢及生理生化过程，在种子萌发、发育，直到幼苗形成的过程中起到极为重要的作用[17]。可溶性糖既是合成其他有机溶质的碳架来源，又是渗透调节剂，还可在细胞内无机离子浓度高时起到保护酶类的作用[15]。

POD和SOD活性测定结果提示，短时间高浓度混合盐胁迫致使POD活性增加，重度组POD活性高于对照组及轻度组。POD活性增高能够保护植物细胞，混合盐浓度越高，POD活性越高；但时间一长，保护系统受到破坏，则会抑制酶活性。本研究还发现，种子发芽后，POD活性呈现降低趋势。SOD是需氧生物中普遍存在的一种酶，能够清除超氧阴离子自由基。高浓度盐胁迫能够诱导SOD活性增强，有效清除植株体内的ROS，减少氧化伤害，从而维持种子的萌发[13]。本研究证实轻、中、重度混合盐处理组SOD活性高于对照组，说明在盐胁迫下，SOD活性增高有利于消除种子内的ROS自由基和过氧化物。

在衰老或逆境条件下，植物体内产生超氧阴离子并大量堆积，对植物造成较大的伤害[9]。本研究结果提示，高浓度盐胁迫下，种子产生超氧阴离子速率大于对照组，证实细胞膜系统受到破坏。

MDA是细胞膜脂过氧化产物，植物在盐胁迫下产生的大量ROS自由基会引起植物的膜脂过氧化，造成MDA的积累，MDA含量可以直接反映种子受伤害的程度[18]。本研究发现，随着时间的延长，对照组急性子MDA含量呈现连续下降趋势；重度组MDA含量则基本平稳，可能是盐胁迫下细胞膜破坏导致MDA积累所致。组间比较，轻度组MDA含量与对照组差异无统计学意义，重度组MDA含量高于轻度组，但差异也无统计学意义，表明本研究中不同浓度的盐胁迫对急性子细胞影响较小。分析原因，笔者认为一方面可能由于本研究中所选混合盐浓度本身对MDA含量影响就比较小，另一方面本研究中盐胁迫程度可能还处于急性子自身代偿范围内。

种子发育过程中积累的贮藏物质（如可溶性糖、可溶性蛋白）是种子萌发、幼苗生长早期所需的物质，反映了种子内可利用态物质和能量的供应基础[11]。可溶性蛋白、可溶性糖测定结果发现，萌发过程中可溶性糖含量升高，对盐胁迫下的急性子有一定的保护作用，其中轻度混合盐胁迫对可溶性糖含量影响不显著，而高浓度混合盐胁迫破环了急性子的细胞结构，使可溶性糖含量增加的趋势受到抑制，且抑制效果显著。种子萌发过程中盐胁迫破坏了种子蛋白质的结构，混合盐浓度越高，可溶性蛋白含量越低。

综上所述，本研究提示混合盐胁迫对急性子萌发过程和生理特性有显著的影响，且浓度越高影响越明显；同时证实急性子对轻度混合盐胁迫具有一定耐受性，但对高浓度混合盐胁迫较为敏感。