PD-1/PD-L1单抗及联合其他疗法增强结直肠癌疗效的研究进展

刘佳程，胡晨曦，李玥，姜伟，刘伟，2

(1. 河北医科大学基础医学院 免疫学教研室，石家庄 050051；2. 河北省重大疾病的免疫机制及干预重点实验室，石家庄 050017)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的恶性肿瘤，50%～60%的患者在诊断时已发生转移。化疗是CRC患者的标准治疗方法，但该方法具有选择性低、肿瘤部位药物浓度低、全身毒副作用明显等局限。目前，FDA已批准包括西妥昔单抗、帕尼单抗、瑞戈非尼单抗、阿柏西普单抗、雷莫芦单抗及贝伐单抗在内的6种治疗转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的靶向药物，提高了患者总生存率[1]。

2018年中国临床肿瘤学会发布的CRC诊断指南，增加了错配修复(mismatch repair，MMR)蛋白和微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)检测结果的判断原则和两者之间相关性的解释，即错配修复基因表达缺失型(deficient mismatch repair，dMMR)表现为高频度微卫星不稳定(microsatellite instability-high，MSI-H)， 错配修复基因表达正常型(proficient mismatch repair, pMMR)表现为低频度微卫星不稳定(microsatellite instability-low，MSI-L)或微卫星稳定(microsatellite-stable，MSS)，分子标志物检测使得对患者的治疗从规范化逐步迈向精准化。dMMR/MSI-H mCRC患者是一个独特的生物标志定义人群，约占CRC患者总数的4%[2]，具有突变负荷高、抗原新表位数量多、CTL浸润不足及免疫检查点表达水平高等特点，患者从传统治疗中获益少[3-4]。免疫检查点抑制剂抗PD-1抗体可增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的抗肿瘤活性，这与dMMR/MSI-H mCRC患者中肿瘤对治疗的反应高度持久和安全可控相关[5]。临床和动物试验显示，将PD-1/PD-L1抑制剂与其他治疗手段联合可进一步增强CRC疗效。

1 PD-1/PD-L1单抗治疗

1.1 PD-1/PD-L1通路T细胞表面的PD-1与肿瘤细胞中表达上调的PD-L1结合，可抑制T细胞增殖活化，使肿瘤细胞逃脱免疫检查。TCR与APC表面的MHC分子结合传递活化信号，可使T细胞释放IFN-γ，IFN-γ与肿瘤细胞表面相应受体结合后通过JAK-STAT信号通路启动干扰素应答基因的表达，如IRF-1，它与PD-L1启动子结合，致使肿瘤细胞表面高表达PD-L1[6]。PD-1与PD-L1结合后，PD-1中ITSM结构域发生磷酸化并募集SHP-2，使下游的Syk和PI3K去极化，进一步抑制T细胞增殖和细胞因子产生[7]。PD-1抑制剂可引起肿瘤微环境中CD8+T细胞和DC间的相互作用，促使IFN-γ(CD8+T细胞)和IL-12(DC)分泌增加，发挥抗肿瘤作用[8]。

1.2 纳武利尤单抗、帕博利珠单抗和阿特珠单抗治疗2017年FDA批准纳武利尤和帕博利珠单抗用于治疗dMMR/MSI-H mCRC。CRC患者的微卫星状态是免疫检查点抑制剂疗效的重要预测指标，MSI-H患者经抗PD-1药物治疗的客观缓解率(objective response rate，ORR)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)明显高于MSI-L/MSS患者。dMMR肿瘤细胞易发生体细胞突变及异常突变蛋白高表达，肿瘤组织中有较多淋巴细胞浸润，同时肿瘤细胞更易表达PD-L1[9]。在MSI-H型CRC中，在低剂量IFN-γ的影响下，PD-L1表达显著上调，并且MSI-H细胞系可通过JAK-STAT信号通路对IFN-γ表现出高反应性[10]。这可能是MSI-H CRC患者应用抗PD-1抗体治疗预后好，抗体治疗应答率高的原因。

纳武利尤单抗作为以PD-1为靶点的单抗药物，被广泛用于治疗包括dMMR/MSI-H mCRC在内的多种肿瘤。Ⅱ期临床试验CheckMate 142招募了来自8个国家、31个地区被确诊为dMMR/MSI-H型CRC的患者74名，其中40名曾接受过3次及以上其他治疗，每2周给予患者3 mg/kg 纳武利尤单抗治疗(表1)。结果发现，在中位随访时间为12个月[四分位距(interquartile range，IQR)范围8.6～18.0]时，23名患者(31.1%，95%CI20.8%～42.9%)达到了研究者评估的ORR，51名患者(68.9%，95%CI57.0%～79.0%)的疾病控制时间持续12周或更长，所有应答者均存活，8名患者持续缓解12个月或更长时间。患者不良反应症状轻，最常见的3～4级与药物相关的不良反应是脂肪酶和淀粉酶浓度升高。以上表明纳武利尤单抗为既往治疗过的dMMR/MSI-H mCRC患者提供了持久的疾病缓解率和疾病控制[11,17-18]。

帕博利珠单抗是FDA于2017年5月批准用于治疗dMMR/MSI-H实体肿瘤患者的PD-1抑制剂。dMMR可使肿瘤对帕博利珠单抗高度敏感，患者对免疫检查点阻断治疗反应良好且持久，毒副作用很小[19]。一项Ⅱ期临床试验中，静脉给予41名CRC患者每2周10 mg/kg 帕博利珠单抗治疗，其中患者先前至少接受了2次及以上其他治疗(表1)。结果显示，MSI-H mCRC患者的ORR为40%，PFS为20周的占78%；而MSS mCRC患者的ORR为0，PFS为20周的占11%，进一步研究发现体细胞高突变负荷与PFS的延长相关(P=0.02)[4]。一项回顾性研究中，选取了3家医院8名晚期MSI-H CRC患者，其中4名局部进展，4名转移。所有患者均接受了纳武利尤单抗或帕博利珠单抗治疗。结果发现，PD-1抗体可致晚期dMMR/MSI-H CRC患者肿瘤消退，有较好的疗效和安全性[20]。Ⅱ期临床试验KEYNOTE-164评估了帕博利珠单抗在已接受治疗的dMMR/MSI-H CRC患者中的抗肿瘤活性，患者在长达2年内每3周接受200 mg 帕博利珠单抗治疗，其中患者接受过≥2种标准治疗，包括氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康(队列A)，或有≥1个既往治疗药物(队列B)(表1)。结果显示，在招募的124名MSI-H/dMMR CRC患者(A组61例，B组63例)中，队列A中位随访时间为31.3个月(IQR 0.2～35.6)，ORR为33%(95%CI，21.0%～46.0%)，PFS中位数为2.3个月(95%CI，2.1～8.1)；队列B中位随访时间为24.2个月(IQR 0.1～27.1)，ORR为33%(95%CI，22.0%～46.0%)，PFS中位数为4.1个月(95%CI，2.1～18.9)。两组患者均未达到中位反应持续时间，与治疗相关的3～4级不良反应发生率在队列A中为16%(n=10)，队列B中为13%(n=8)，其中最常见的不良反应(发生在≥2名患者中)包括胰腺炎、疲劳和丙氨酸转氨酶升高[12]。这些研究表明，帕博利珠单抗对MSI-H/dMMR CRC患者有效，且安全性可控。

阿特珠单抗作为以PD-L1为靶点的药物，治疗CRC患者效果不佳。一项Ⅰ期临床试验中，研究者招募了175名晚期实体瘤患者，包括6名CRC患者，给予其3 次/周阿特珠单抗治疗，给药剂量范围从0.01～20.00 mg/kg逐渐增加，治疗耐受情况良好，CRC患者在48周时停止治疗，结果显示无明显疗效[13,21](表1)。

表1 免疫检查点药物治疗CRC的临床试验

2 联合治疗

2.1 联合放疗电离辐射和放射增敏剂维利帕尼可以通过潜在的互补作用机制增强CRC患者对抗PD-1/PD-L1抗体的反应性。电离辐射可显著增加CT26细胞系IFN-α和CXCL10的表达，维利帕尼以剂量依赖的方式增加MC38细胞系MHCⅠ和PD-L1表面定位。在两种肿瘤模型中，同时给予维利帕尼和电离辐射治疗可显著促进抗PD-1抗体介导的延迟体内肿瘤生长作用，从而延长生存期。此外，电离辐射和维利帕尼增强抗PD-1/PD-L1抗体介导的肿瘤生长抑制会因CD8+T细胞耗竭而减弱[22]。

2.2 联合化疗奥沙利铂(oxaliplatin，OxP)是CRC一线化疗药物，研究发现OxP在CT26-FL3小鼠中可诱导免疫原性细胞死亡，与对照组相比，原位CT26-FL3肿瘤中CD8+T细胞、CD4+T细胞和活化的DC数量增加，OxP治疗的小鼠肿瘤组织中PD-L1表达升高。应用OxP及OxP联合抗PD-L1抗体治疗时，联用组有更显著的肿瘤抑制效果，表明OxP与抗PD-L1抗体联用具有协同效应[23]。PD-L1抑制剂德瓦鲁单抗可显著改善CT26 CRC小鼠的存活率，通过与OxP联用可进一步增强PD-L1抑制剂的抗肿瘤活性，并使肿瘤内HMGB1的释放量增加[24]。PD-1/MS(MUC1和生存素)疫苗可将肿瘤抑制率从17.18%提高至30.96%，并使小鼠存活率从6.96%延长至19.44%，进一步研究显示，PD-1/MS疫苗与OxP联用可将肿瘤抑制率提高至74.71%[25]。

肿瘤微环境内，共表达PD-1和TIM-3的CD8+TIL被认为是功能失调细胞，TIM-3-TCF-1hi表型的TIL被认为是功能增强细胞。而FOLFOX处理的CRC小鼠模型中， CD8+TIL保持低水平的PD-1和TIM-3为特征的功能分化状态和CD38loCD101loTIM-3-TCF-1hi细胞表型。抗PD-1抗体没有增加肿瘤微环境内具有TIM-3-TCF-1hi表型的TIL，从而使抗PD-1抗体联合FOLFOX化疗抗肿瘤疗效更优[26-27]。地西他滨诱导DNA低甲基化，可直接增加肿瘤细胞PD-L1的表达，也可改造肿瘤免疫微环境的免疫原性并促进淋巴细胞浸润。联合抗PD-L1抗体与OxP治疗可发挥更强的抗肿瘤免疫反应，重塑肿瘤微环境，抑制肿瘤生长，为CRC患者提供潜在的临床获益[28]。

一项Ⅱ期临床试验将最初无法切除和先前未接受治疗的201名mCRC患者(无论微卫星状态如何)以1∶2的比例随机分配，患者单独接受多达8个周期的一线联合化疗药物(FOLFOXIRI)/VEGF拮抗剂(贝伐单抗)，在此基础上联合阿特珠单抗治疗，直至疾病进展，PFS为主要研究指标，该试验正在进行中[15](表1)。

2.3 联合免疫疗法

2.3.1 联合CTLA-4抑制剂 CTLA-4作为重要的免疫检查点，介导肿瘤负向免疫调控。它是一种细胞内蛋白，在TCR参与并通过CD28发出共刺激信号后，被转运到细胞表面，与CD80/86结合后，在活化的B细胞和单核细胞上传递抑制性信号，同时介导抑制性信号传入T细胞，抑制T细胞的增殖和活化。临床上应用伊匹单抗和曲美木单抗可阻断CTLA-4的活化[6，19]。

联合免疫检查点阻断的免疫疗法相较单一的免疫检查点抑制剂治疗更有可能提高肿瘤患者的生存率。目前，纳武利尤单抗联合伊匹单抗已被批准用于治疗恶性黑色素瘤、小细胞肺癌等。临床研究表明，伊匹单抗和纳武利尤单抗均可提高患者的无复发生存率，且联用比单一使用纳武利尤单抗疗效更优，尤其在具有高突变负荷的肿瘤患者中，联用的疗效进一步增强[29-30]。dMMR/MSI-H mCRC具有突变负荷高、抗原新表位数量多、免疫检查点表达上调等特点，临床上采用联合免疫检查点阻断的疗法可使患者获得更多益处。CheckMate 142Ⅱ期临床试验纳入了119名CRC患者，分别给予纳武利尤单抗(3 mg/kg)与伊匹单抗(1 mg/kg)，每3周给药1次，连续4次，随后接受纳武利尤单抗(3 mg/kg)，每2周给药1次，直至肿瘤进展、患者死亡或出现不可接受的毒副作用(表1)。在中位随访时间为13.4个月时，研究者评估的ORR为55% (95%CI， 45.2%～63.8%)，12周疾病控制率为80%，PFS分别为76%(9个月)和71%(12个月)，总体生存率分别为87%和85%。相较单一的纳武利尤单抗治疗，这一研究结果显示纳武利尤单抗与伊匹单抗联合治疗dMMR/MSI-H mCRC具有较好的安全性和显著的临床疗效[14]。

后续深入研究显示，在纳入的119名患者中，25%、23%、19%、5%、5%和29%的患者分别经历内分泌、胃肠道、肝脏、肺、肾脏和皮肤相关的不良反应，大多数人(57%)是1或2级不良反应，症状发生在早期[中位数发病时间(time to onset，TTO)5.2～12.6周]。非内分泌相关不良反应在大多数(>71%)患者中消退[中位数解决时间(time to resolution，TTR)1.5～9.0周]，使用免疫调节药物(immune-modulating medication，IMM)改善了22%～56%患者的治疗相关不良反应[31]。

2.3.2 联合共刺激分子抑制剂 采用MC38 CRC小鼠模型进行活体成像技术和单细胞测序分析，发现CD40抑制剂可通过激活NF-κB通路使肿瘤对抗PD-1抗体治疗增敏，并发现只有联合治疗的方案能取得显著而持续的抗肿瘤作用[8]。采用CT26 CRC小鼠模型发现，抗4-1BB mIgG2a与去糖基化的抗PD-1抗体结合，治愈率达80%，而单一疗法的治愈率仅为20%～25%，表明联合治疗或许可提高CRC的免疫治疗效果[32]。

2.3.3 联合溶瘤病毒 溶瘤病毒疗法是使用一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，通过其连续复制最终杀灭肿瘤细胞的疗法。有研究使用一种可表达CXCL11的牛痘病毒作为溶瘤病毒，发现在CRC小鼠中，相较单一使用抗PD-L1抗体，联合疗法可显著增强疗效，减轻肿瘤负荷并提高小鼠生存率[33]。研究发现，具有IL-15-IL-15Rα融合蛋白的溶瘤病毒与抗PD-1抗体的联合使用可显著消退CRC小鼠肿瘤，提高其存活率[34]。CSF-1R抑制剂(PLX3397)、溶瘤病毒和抗PD-1抗体的三联组合可将免疫抑制性肿瘤微环境转变为利于抗肿瘤免疫的微环境，显著控制小鼠肿瘤的生长，提高小鼠存活率[35]。溶瘤病毒VSV-IFN-β(表达IFN-β的溶瘤性水疱性口炎病毒)与抗PD-L1抗体联用可延长CT26肿瘤小鼠的PFS[36]。以上动物试验结果提示，抗PD-1/PD-L1抗体联合溶瘤病毒是有前景的CRC疗法。

2.3.4 联合CAR-T疗法 目前，抗PD-1抗体和CAR-T等疗法均未在CRC中取得理想疗效，且不同免疫抑制途径的存在可能会阻碍CAR-T细胞疗法，因而，联合治疗成为一种新的思路。在一项表达抗Her-2 CAR的原代小鼠T细胞研究中，阻断PD-1可通过增加CAR-T细胞中的重要功能参数，增强CAR-T疗效[37]。另一项研究中，研究者设计了可分泌抗PD-1抗体的CAR-T组成型细胞，观察到连续分泌抗PD-1抗体对PD-1的阻断作用在体内外均减弱了抑制性T细胞信号转导，增强了T细胞的增殖和效应功能，表明了二者联合治疗具有更好的效果[38]。此外，有研究表明，癌胚抗原CEA可作为CAR-T细胞治疗CRC的一个良好靶点，一项针对CEA+CRC患者的Ⅰ期临床试验观察到，即使在高剂量作用下，癌细胞在接受细胞疗法的CEA+CRC患者中也具有良好的应答率，在大多数接受治疗的患者中都观察到较好的疗效，这预示了这一靶点在治疗CRC中的潜在作用，与其他类型的CAR-T细胞联合应用可增强疗效[39]。

2.4 联合其他潜在治疗手段

2.4.1 联合靶向药物 抗PD-1抗体纳武利尤和帕博利珠的免疫治疗以肿瘤微环境为目标，联合VEGF抑制剂贝伐单抗可提高mCRC患者生存率[40]。在CRC光化学疗法中，EGFR抑制剂联合抗PD-L1抗体免疫治疗具有协同作用，一定程度上防止肿瘤复发[41]。

2.4.2 联合m6A治疗 研究发现YTHDF1缺陷型小鼠与WT小鼠相比，CD8+T细胞抗肿瘤反应增强，CD8+T细胞中PD-L1表达上调。未经治疗的YTHDF1缺陷型小鼠和应用抗PD-L1抗体治疗的WT小鼠肿瘤消退程度仅为40%，抗PD-L1抗体处理的YTHDF1缺陷型小鼠的肿瘤消退程度可达100%。此外，肿瘤间质中低表达YTHDF1的CRC患者肿瘤活检组织中CD8+T细胞数量常高于YTHDF1高表达的患者，提示联合使用调控m6A相关蛋白水平的药物和抗PD-1/PD-L1药物或许能够提高CRC患者肿瘤消退程度[42]。

3 结语

PD-1/PD-L1免疫疗法是极具前景的肿瘤免疫疗法，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路可使肿瘤细胞死亡，改善肿瘤患者预后。单一或联合使用抗PD-1/PD-L1抗体都只对大部分dMMR/MSI-H mCRC患者显示出较优疗效，而对MSS型CRC患者，效果均不佳。针对该“无效人群”的有效治疗离不开肿瘤免疫研究的发展，如何进一步通过联合免疫疗法提高CRC患者的疗效并减少其副作用是未来研究的重要方向。