不同检测方法在孕妇B 族链球菌筛查中的应用效果比较

张霜

B 族链球菌(GBS)即无乳链球菌主要定植于女性生殖道和消化道,是造成孕生妇围生期感染的主要病原菌之一。GBS 可能会造成孕妇早产、胎膜早破,还可能传染给胎儿,导致胎儿宫内感染,出现脑膜炎、败血症等严重并发症［1］。因此做好GBS 定植的筛查,积极进行针对性的抗生素干预,对于保障母婴的生命安全有重要的意义。本次研究对于常规血琼脂培养法、显色培养法及PCR法筛查孕妇GBS的效果进行了比较,报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年3 月～2019 年12 月本院产科门诊的715 例孕晚期孕妇作为研究对象。孕妇年龄22～45 岁,平均年龄(30.1±5.0)岁；其中初产妇 420 例(58.74%),经产妇295 例(41.26%)。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器 选用ABI 公司的7500 RES-TIME 型荧光定量PCR 扩增仪、梅里埃公司的VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统,以及其配套的GP 鉴定卡。

1.2.2 试剂 梅里埃公司的GBS 分群凝集试剂盒、哥伦比亚血琼脂培养基。泰普生物科学公司的GBS 核酸检测试剂盒和GBS 显色培养基。金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和无乳链球菌(ATCC12386)的质控菌株由中国医学微生物菌种保藏中心提供。选择性T-H 增菌肉汤由英国OXOID 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 对所有孕妇均采集其阴道和肛周分泌物标本。阴道和肛周分泌物样本采集的位置在阴道口1/3 处、括约肌上面3 cm 左右处。使用无菌拭子,小心旋转1 圈取得分泌物样本。

1.3.2 样本检测 采集样本分别采用常规细胞培养法、显色培养法及荧光PCR 法进行GBS 筛查,并以T-H 肉汤增菌培养法为参考标准。①常规血琼脂培养法：将标本接种至哥伦比亚血琼脂培养基上,分区划线后,放入CO2培养箱,在35℃,5%～6% CO2下孵育24 h。取出培养皿,通过观察菌落的形态特征和β 溶血特性进行寻找GBS 菌落。选取β 溶血灰白色,且革兰染色为阳性的可疑菌落,进行进一步的触酶试验、CAMP 试验和溶血试验,以筛选GBS 菌落。对于筛选出的GBS 菌落采用VITEK 2 Compact 细菌鉴定及药敏分析系统进行最终的鉴定和确认。②显色培养法：将标本接种至显色培养基上,分区划线,置入CO2培养箱,以同样条件孵育24 h。孵育完成后,挑选红色的可疑菌落进行CAMP 试验,对于CAMP 试验阳性的菌落采用VITEK 2 Compact 细菌鉴定及药敏分析系统进行最终的鉴定和确认。③荧光PCR 法：将标本加入缓冲液高速震荡摇匀制备成标本悬浮液。离心5 min (13000 r/min)取沉淀物。加入缓冲液再次以同样转速离心5 min,保留沉淀物。加入100 μl 的TE 缓冲液进行重悬,并加入内参物。高速震荡5 min 后先干浴120 s,再进行冰浴300 s,最后再进行离心60 s 留取上清液。取5 μl 上清液作为PCR 检测样本加入反应管中进行PCR 扩增,按照GBS 核酸检测试剂盒的说明书进行结果的判断。④T-H 肉汤增菌培养法：将取的拭子标本加入T-H 增菌肉汤中,充分混匀后,放入CO2培养箱,在35℃,CO2浓度为5%～6%的条件下进行孵育24 h左右。然后接种至血平板上,寻找可疑菌落,并对可疑菌落进行处理,处理方法与常规血琼脂培养法相同。

1.4 观察指标 以T-H 肉汤增菌培养法为参考标准,比较不同检测方法筛查GBS 的灵敏度、特异度。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

715 例孕晚期孕妇经T-H 肉汤增菌培养法检测阳性68 例,阳性率为9.51%。以T-H 肉汤增菌培养法为参考标准,常规细菌培养法检测的GBS 的灵敏度、特异度分别为64.71%、99.85%；显色培养法分别为91.18%、99.69%,荧光PCR 法分别为95.59%、99.85%。显色培养法及荧光PCR 法筛查GBS 的灵敏度均高于常规细菌培养法,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 不同检测方法的GBS 筛查结果比较(n)

3 讨论

常规血琼脂平板细菌培养是目前GBS 筛查的常用手段。但是其对于菌落的最低检测量要求较高,而样本中细菌种类过多,未经挑选进行培养,一些肠杆菌繁殖迅速,会限制GBS 的生长,使得GBS 的菌量未达到最低检测量,容易发生漏检［2］。且常规细胞培养的耗时长,需孵育过夜,且培养结果容易受到标本采集和运送过程影响。而显色培养法利用GBS 在厌氧条件下能合成橙红色的类胡萝卜素,从而形成橙红色菌落进行GBS 的筛选,再对特征性颜色的菌落进行鉴定和检验,具有较高的灵敏度。不过一些链球菌如化脓链球菌等在同样条件下会形成类似颜色的色素,另外还有较少比例的GBS 不会产生类胡萝卜素,约在5%左右,故还是存在一定的漏检或误检［3］,本次研究中即有2 例化脓链球菌被误检为GBS。而荧光PCR 是针对GBS 设计特异性引物,在体外通过PCR 反应扩增得到特定的DNA 片段,加以荧光染料标记探针,从而检测GBS 的核酸片段。荧光PCR 检测的灵敏度极佳,阳性率高,且检测迅速。贾忠兰等［4］的研究结果显示,荧光PCR 筛查GBS 的灵敏度最佳。本次研究对于常规血琼脂培养法、显色培养法及荧光PCR 法三种方法筛查孕妇GBS 的效果进行了比较,结果显示显色培养法及荧光PCR 法的GBS 筛查灵敏度高于常规细菌培养法(P＜0.05)。这与既往高坎坎等［5］的研究一致,荧光PCR 法和显色培养法在孕妇GBS 筛查中的应用价值较高,而常规细胞培养的筛查效果不够理想。荧光PCR法检测迅速,灵敏性好,但成本较高,而显色培养法操作简单,成本低,且在筛选纯化GBS 后,还可进一步进行药敏试验但相对耗时,临床可根据具体情况选用。

综上所述,荧光PCR 法和显色培养法在孕妇GBS筛查中的应用价值较好,临床可根据具体情况选用。