miR-4319通过靶向TNFAIP3调控强直性脊柱炎成纤维细胞成骨分化

周华朝，张 武

(枣庄矿业集团枣庄医院 外三科,山东 枣庄277100)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性炎性自身免疫性疾病，主要为轴骨骼和骶髂关节炎症症状，导致结构和功能受损。全球人群中AS的患病率为0.7%-3.2%，男性患者的数量约为女性患者的2倍[1-2]。目前，尽管尚不清楚AS的发生机理，但可以确定其具有遗传易感性，先天免疫方面与环境因素相结合被认为在AS的发展中起着至关重要的作用。miRNA在AS疾病中的功能也有研究报道[3-4]，但是miR-4319在AS中的功能尚未十分清楚。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3(TNFα-inducible protein 3 antibody，TNFAIP3)是核转录因子kappaB(nuclear transcription factor kappaB，NF-κB)NF-κB信号传导的内源性负调节剂，已在多种自身免疫和炎性疾病中被广泛描述，如慢性肺炎[5]。本研究旨在探究miR-4319在AS成纤维细胞成骨分化中的功能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

组织标本来自枣庄矿业集团枣庄医院外科需要进行全髋关节置换术的AS患者6例，外伤导致股骨胫骨骨折需做髋骨置换术的非自身免疫疾病的患者6例。患者及家属均签有知情同意书。杜氏细胞培养基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)购自Gibco；青链霉素双抗混合液购自Hyclone；胎牛血清购自杭州四季青公司；Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒购自美国Millipore；RNA下拉试剂盒(pull-down)、生物素3′末端标记试剂盒(pierce RNA 3′ end biotinylation kit)购自Thermo；双荧光素酶报告实验试剂盒购自Promega；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒、羟脯氨酸检测试剂盒、放免法骨钙素检测试剂盒均购自南京建成生物工程公司；所涉及的质粒构建、引物设计合成均送至上海吉玛公司完成。

1.2 方法

1.2.1细胞分离培养

按照冯仲锴等[6]的方法分离培养AS成纤维细胞。

1.2.2分组处理

将培养的AS成纤维细胞、正常成纤维细胞分别标记为AS成纤维细胞组、正常成纤维细胞组。将AS成纤维细胞随机分为pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-TNFAIP3组(转染pcDNA-TNFAIP3)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-4319组(转染miR-4319 mimics)、miR-4319+pcDNA组(共转染miR-4319 mimics和pcDNA)、miR-4319+pcDNA-TNFAIP3组(共转染miR-4319 mimics和pcDNA-TNFAIP3)。具体的处理方法为：将脂质体与质粒或DNA按照脂质体与质粒或DNA之比为3∶1的量混合均匀，然后加入AS成纤维细胞中培养5 h，再补充新培养继续培养48 h，用RT-qPCR检测细胞转染的效率，确认转染成功后用于后续实验。

1.2.3RT-qPCR实验

将等待检测的细胞提取总RNA并合成cDNA，作为模板。用RT-qPCR试剂盒检测细胞中miR-4319、TNFAIP3的表达。结果以U6、GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-4319、TNFAIP3的表达水平。miR-4319，上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACG-ACGTGGCT-3′，下游引物 5′-CACCCAGAGCAAAGCCAC-3′；U6，上游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH，上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；TNFAIP3的引物由上海吉玛公司设计合成。

1.2.4Western blot实验

将等待检测的细胞进行充分裂解，提取总蛋白进行定量和变性处理。取变性后的蛋白用于蛋白电泳。电泳时先进行稳压电泳，再进行温流电泳。结束后将蛋白用转膜仪转移至PVDF膜上，结束后将膜进行5%脱脂奶粉的封闭处理，然后再将膜浸入一抗(多克隆抗体TNFAIP3，1∶1 000)溶液中，4℃孵育过夜。第2天，将膜转移至二抗(辣根过氧化物酶标记的二抗，1∶2 000)溶液中，37℃孵育2 h。结束后，将膜进行显影、曝光。

1.2.5生物信息学预测

通过生物信息学在线预测网站targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测到miR-4319 与TNFAIP3之间存在靶向结合位点。

1.2.6双荧光素酶报告实验

首先，根据预测到的TNFAIP3结合位点，设计含有TNFAIP3结合位点(WT-TNFAIP3)和不含有结合位点的突变序列(MUT-TNFAIP3)，并将其克隆至荧光载体，构建荧光素酶报告基因载体质粒。将载体质粒分别与miR-NC、miR-4319共转染至AS成纤维细胞。用双荧光报告实验试剂盒检测细胞中荧光虫荧光素酶的活性和海肾荧光素酶的活性。结果用二者的比值表示细胞的荧光素酶活性。

1.2.7RIP实验

通过Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒进行RIP实验分析。集体操作为：收集培养的AS成纤维细胞并将其用RIP裂解缓冲液重悬，并将其与含有抗Ago2抗体或IgG抗体缀合的磁珠在4℃孵育过夜。次日，洗涤3次后，将磁珠与蛋白酶K一起温育。随后提取其中的总RNA并合成cDNA，通过RT-qPCR分析确定TNFAIP3的相对表达。

1.2.8RNA pull-down实验

先用pierce RNA 3′ end biotinylation kit标记生物素NC和生物素miR-4319。用RNA pull-down试剂盒操作，将生物素标记物与准备好的磁珠在4℃条件下孵育过夜。次日3 000 rpm/min离心，弃上清，缓缓加入RIP洗涤液。再向磁珠RNA混合物中加入细胞裂解液，低速离心后取上清进行SDS-PAGE蛋白电泳。检测分析TNFAIP3的富集情况。

1.2.9骨向分化标记物ALP、胶原、骨钙素含量检测

ALP火星的检测：使用ALP活性检测试剂盒检测。首先，收集等待检测的细胞，充分裂解，然后按照试剂盒说明书要求操作和结果判定分析要求分析，检测结果。ALP活性(U/L)为(OD实验-OD空白)×总体积反应×1000/总体积样本×18.5。

胶原含量检测：采用羟脯氨酸比色法检测待检测细胞的培养上清液中Ⅰ胶原的含量。

骨钙素含量检测：采用125I放免法检测待检测细胞的培养上清中骨钙素的含量。

1.2.10统计学处理

本实验所涉及的所有实验数据均用均数±标准差的形式计量，用SPSS22.0软件进行分析。多组间数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，两组数据比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计意义。

2 结果

2.1 miR-4319、TNFAIP3在AS成纤维细胞中的表达

结果如表1和图1所示，与正常成纤维细胞相比，AS成纤维细胞中miR-4319表达显著升高，TNFAIP3的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05)。

图1 TNFAIP3的蛋白表达图

表1 miR-4319、TNFAIP3在AS成纤维细胞中的表达

2.2 miR-4319靶向TNFAIP3

生物信息在线预测结果显示，miR-4319与TNFAIP3之间存在连续7个互补的核苷酸序列(图2)。双荧光素酶实验结果见表2，与miR-NC组相比，miR-4319组WT-TNFAIP3细胞的荧光活性显著降低；RIP实验结果，见表3，与miR-NC组相比，miR-4319组Ago2-TNFAIP3/GAPDH的表达显著升高；Pull-down实验结果见表4，与生物素NC探针组相比，生物素TNFAIP3探针组相关miR-4319富集显著升高(P<0.05)。

图2 核苷酸结合位点

表2 双荧光素酶实验结果

表3 RIP实验结果

表4 Pull-down实验结果

2.3 过表达TNFAIP3对AS成纤维细胞成骨分化的影响

结果如表5所示，与pcDNA组相比，pcDNA-TNFAIP3组AS成纤维细胞中TNFAIP3的含量显著升高，ALP、胶原、骨钙素的含量均显著升高(P<0.05)。

表5 过表达TNFAIP3的AS成纤维细胞的成骨分化

2.4 过表达miR-4319对AS成纤维细胞成骨分化的影响

结果如表6所示，与miR-NC组相比，miR-4319组细胞中miR-4319表达显著升高，ALP、胶原、骨钙素的含量均明显下调(P<0.05)。

表6 过表达miR-4319的AS成纤维细胞的成骨分化

2.5 敲减TNFAIP3部分逆转抑制miR-4319对AS成纤维细胞成骨分化的调控

结果如表7所示，与miR-4319+pcDNA组相比，miR-4319+pcDNA-TNFAIP3组细胞中miR-4319表达显著降低，ALP、胶原、骨钙素的含量均发生明显上升(P<0.05)。

表7 敲减TNFAIP3部分逆转抑制miR-4319对AS成纤维细胞成骨分化的影响

3 讨论

到目前为止，对于AS的早期诊断和治疗，尚未找到合适的方法。microRNA(miRNAs)是一种内源性的小的非编码RNA，控制着靶基因和细胞生物过程的功能，以稳定的形式存在于人的血浆中，并可能作为疾病活动、发病机制和预后的生物标志物[7]。Marzena等[8]报道，在AS中miRNA-5196在TNF-α治疗之前的表达显著高于抗TNF-α治疗或者健康者，为AS的诊断和抗TNF-α患者的判断提供依据。Wang等[9]报道，在AS患者的T细胞中，miR-199a-5p和自噬相关基因LC3、beclin1和ATG5的表达明显降低，miR-199a-5p表达水平也与AS患者的强直性脊柱炎疾病活动评分呈显著的负相关，过表达miR-199a-5p后能够促进自噬相关基因的表达并抑制致炎因子的分泌，产生这种作用的机制与miR-199a-5p靶向脑内富集Ras同系物(Ras homolog enriched in brain，Rheb)抑制雷帕霉素(rapamycin，mTOR)信号通路有关。Tetsuya等[10]在骨关节炎软骨细胞的研究提示，miR-4319在正常软骨细胞中几乎不表达，在骨关节炎软骨细胞中表达，但是其在骨关节炎中的功能未曾进一步研究。本研究发现，miR-4319在AS成纤维细胞中的表达异常升高，这是首次发现该miRNA在AS中失调。进一步研究还发现，过表达miR-4319能够抑制AS成纤维细胞的成骨分化，这揭示了miR-4319在AS中抑制AS成纤维细胞骨向分化的功能，为探索miR-4319在AS中的其他功能奠定基础。深入研究发现，miR-4319可靶向TNFAIP3，这也许与miR-4319在AS中的抑制AS成纤维细胞骨向分化的功能有联系。

TNFAIP3利用泛素相关的功能来调节免疫激活，其缺乏与自身免疫性疾病高度相关[11-12]。Yang等[13]报道，TNFAIP3 rs10499194的基因多态性与AS风险的降低具有紧密的相关性。Ran等[14]在AS的研究中运用微阵列分析发现，TNFAIP3在AS患者样品组织中的表达不足，这对AS患者的诊断、预测具有指导意义。Zhai等[15]在研究中发现，TNFAIP3在AS患者外周血非单核细胞中的表达异常降低，沉默TNFAIP3后可促进单核细胞炎症的形成，并诱导自噬，在自身免疫性疾病中发挥重要作用。本研究发现，在AS成纤维细胞中TNFAIP3的表达异常降低，这与前辈的实验结果相一致，再次证明了TNFAIP3在AS中的表达缺失。进一步研究发现，过表达TNFAIP3的AS成纤维细胞中成骨分化标志物ALP、胶原、骨钙素的含量异常上升，促进AS成纤维细胞的成骨分化。这暗示TNFAIP3低表达对AS成纤维细胞的成骨分化具有抑制功能。