刺芒柄花素激活脑外伤小鼠Nrf2/HO-1通路减轻脑水肿并改善行为障碍

胡志平,马 俊,陈彦蓉,周珍贵

(湖北省公安县人民医院 神经外科，湖北 公安434300)

脑外伤具有很高的发病率和死亡率，是一种严重威胁人类健康和社会经济问题的疾病[1]。脑外伤可诱发脑组织缺血缺氧，触发瀑布式神经生化降解过程的损伤级联反应，与氧化应激损伤密切相关[2-3]。而脑水肿、行为障碍等是脑外伤患者早期重要病理变化及严重并发症，也是导致病情进展甚至恶化死亡的重要因素[4]。刺芒柄花素(formononetin，FOR)是一种异黄酮类物质，近来研究报道其可能通过抗氧化应激和抗细胞凋亡作用对脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定保护作用[5]，但其对脑外伤小鼠脑水肿及行为障碍是否亦具有保护作用及其作用机制尚鲜有研究。核因子e2相关因子2(nuclear factor e2-related factor 2，Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路是一种内源性抗氧化系统核心调控枢纽，对大鼠液压式脑损伤、创伤性脑损伤中神经细胞修复均具有保护作用[6-8]。基于此，本研究拟通过探究FOR对脑外伤小鼠脑水肿及行为障碍的影响，以期揭示其作用机制，为临床脑外伤患者早期治疗提供一定参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量20 g-22 g(货号：jlc0008)，购自上海莱克实验动物有限责任公司/上海灵畅生物科技有限公司。饲养条件：均于温度为(23±2)℃、湿度为(50±10)%，12 h/12 h光照/黑暗，自由饮水饮食环境下饲养。本研究动物实验经本院动物实验伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

FOR(纯度≥98%，货号：485-72-3)、依达拉奉注射液(edaravone，EDA，批准文号：国药准字H20080056)购自国药集团国瑞药业有限公司；亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒(货号：AR0106)购自武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010S)购自上海碧云天有限公司；兔源一抗anti-Nrf2抗体(货号：ab62352)、anti-HO-1抗体(货号：ab137749)、anti-GAPDH抗体(货号：ab181602)、二抗山羊抗兔IgG(货号：ab6721)均购自英国Abcam公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(货号：k335-100)购自艾美捷科技生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(货号：A003-1-2)购自南京建成生物工程研究所；MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1建模与分组

采用改良Feeney自由落体撞击法制备脑外伤小鼠模型，随机选取80只C57BL/6小鼠，用2%戊巴比妥钠麻醉后，沿其颅顶正中线切开头皮，以冠状缝旁1.5 mm及矢状缝旁2.5 mm处为原点，电动磨钻钻约5 mm×5 mm骨窗，并于骨窗正中安置撞垫，将40 g砝码从25 cm高处沿落体引导管坠落至颅脑损伤，止血冲洗后，骨蜡封闭，缝合头皮。其中死亡5只，造模成功75只。随机分为模型组(Model组)、阳性药物依达拉奉组(EDA组)、FOR低剂量组(25 mg/kg)、FOR中剂量组(50 mg/kg)、FOR高剂量组(100 mg/kg)，假手术组(Sham组)操作步骤同造模但不予以颅脑打击，每组5只，每组3个平行亚组。伤后30 min，EDA组、FOR低、中、高剂量组分别5 mg/kg EDA[9]、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg FOR进行腹腔注射给药，Sham组和Model组给予等量生理盐水腹腔注射，均每天1次，连续3天。

1.3.2神经损伤评分(neurologic severity score，NSS)测定[10]

分别于伤后2 h、1 d、3 d处死小鼠前，通过运动实验、感觉实验、平衡能力测试、反射实验对大鼠进行NSS评分，最高18分，得分越高，说明神经系统损伤越严重。

1.3.3脑组织水含量测定

分别于伤后2 h、1 d、3 d给药结束后，10%水合氯醛腹腔麻醉处死，断头取脑，并分成左右两半，取左脑标本先用滤纸吸除表面水分后，称取湿重(wet weight，W)，再经110℃烤箱烘烤24 h后称取干重(dry weight，D)。其中脑组织水含量=(W-D)/W×100%。

1.3.4脑组织SOD、MDA水平检测

采用定量检测试剂盒测定各组小鼠脑组织匀浆标本中氧化应激指标SOD、MDA水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.5脑组织组织中N-Nrf2、C-Nrf2、HO-1蛋白表达情况检测

取各组伤后2 h、1 d、3 d小鼠脑组织部分标本，迅速置于液氮中保存。严格按照蛋白提取试剂盒说明提取各组小鼠脑组织胞核、胞浆总蛋白，并采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，置于-80℃保存备用。蛋白样品于80 mV电压下6% SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，添加anti-Nrf2(稀释比1∶1 000)、anti-HO-1(稀释比1∶500)、anti-GAPDH(稀释比1∶500)抗体4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，添加二抗IgG(稀释比1∶5 000)室温孵育1 h，按上述方法洗膜，显色，曝片，观察结果并拍照分析各蛋白条带灰度值，分别以靶蛋白灰度值与内参GAPDH条带比值为目标蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠NSS评分比较

伤后1 d，与Model组比较，FOR低、中、高剂量组小鼠NSS评分依次降低(P<0.05)；FOR高剂量组NSS评分高于EDA组(P<0.05)。伤后3 d各组小鼠NSS评分变化趋势与伤后1 d一致。随时间延长，各组小鼠NSS评分呈先升高后降低趋势。见图1。

2.2 各组小鼠脑组织水含量变化

伤后1 d，与Sham组比较，Model组小鼠脑组织水含量增加(P<0.05)；与Model组比较，FOR低、中、高剂量组小鼠脑组织水含量依次降低(P<0.05)；FOR中、高剂量组小鼠脑组织水含量高于EDA组(P<0.05)。伤后3 d各组小鼠脑组织水含量变化趋势与伤后1 d一致。除Sham组，其余各组随时间延长小鼠脑组织水含量呈先升高后降低趋势。见图2。

图2 各组小鼠脑组织水含量变化(n=5)

2.3 各组小鼠脑组织中SOD、MDA水平比较

伤后1 d，与Sham组比较，Model组小鼠脑组织SOD水平降低、MDA水平增加(P<0.05)；与Model组比较，FOR低、中、高剂量组小鼠脑组织SOD水平依次升高、MDA水平依次降低(P<0.05)；与EDA组比较，FOR中、高剂量组小鼠脑组织SOD水平升高、MDA水平降低(P<0.05)。伤后3 d各组小鼠脑组织SOD、MDA水平变化趋势与伤后1 d一致。随时间延长，除Sham组，其余各组小鼠脑组织SOD水平呈先降低后升高趋势，MDA则反之。见图3。

图3 各组小鼠脑组织SOD、MDA水平比较

2.4 各组小鼠脑组织中C-Nrf2、N-Nrf2、HO-1蛋白表达变化

伤后1 d，与Sham组比较，Model组小鼠脑组织中C-Nrf2、N-Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著增加(P<0.05)；与Model组比较，FOR低、中、高剂量组小鼠脑组织中C-Nrf2蛋白水平依次降低(P<0.05)，N-Nrf2、HO-1蛋白表达水平依次升高(P均<0.05)；与EDA组比较，FOR高剂量小鼠脑组织N-Nrf2、HO-1蛋白表达水平增加，C-Nrf2蛋白表达降低(P>0.05)。随时间延长，除Sham组，其余各组小鼠脑组织C-Nrf2水平呈先升高后降低趋势，N-Nrf2、HO-1蛋白表达水平呈持续升高趋势。见图4及图5、图6、图7。

图4 免疫印迹检测各组小鼠脑组织中C-Nrf2蛋白表达

图5 免疫印迹检测各组小鼠脑组织中N-Nrf2蛋白表达

图6 免疫印迹检测各组小鼠脑组织中HO-1蛋白表达

图7 各组小鼠脑组织C-Nrf2、N-Nrf2、HO-1蛋白表达情况比较(n=5)

3 讨论

本研究首先采用改良Feeney法重物自由落体瞬间机械冲击造成小鼠原发性颅脑外伤，结果发现，与Sham组比较，Model组小鼠伤后2 h脑组织水含量、NSS评分差异无统计学意义，伤后1 d脑组织水含量、NSS评分均显著增加，伤后3 d脑组织水含量、NSS评分呈降低趋势。脑外伤包括原发性损伤和继发性损伤，脑外伤后可启动一系列生化过程引起继发性、进行性损伤，其过程主要包括氧化应激反应导致的大量活性氧和自由基触发蛋白质氧化水解、核酸链断裂等一系列瀑布式级联反应，加重脑组织细胞损伤，引发脑组织水肿、行为障碍等早期临床症状。以上结果提示本研究脑外伤小鼠模型制备成功，可用于后续试验；另随脑外伤时间延长，小鼠机体本身可能存在损伤修复作用。

FOR是红车轴草的主要有效成分，研究显示，其在抗炎、抗氧化应激、神经组织修复等过程中起重要作用。田心等[11]研究报道，FOR可抑制高糖诱导的小鼠系膜细胞NF-κB信号通路激活及系膜细胞增殖。Li等[12]研究报道，FOR可通过抑制大鼠皮层神经元IL-10表达抑制神经炎症反应，对脑外伤大鼠具有神经保护作用。本研究结果发现，与Model组比较，FOR低、中、高剂量组可依次降低脑外伤小鼠NSS评分、脑组织水含量，且FOR高剂量组效果优于EDA组；与伤后1 d比较，伤后3 d Model组小鼠脑组织水含量、NSS评分降低，提示FOR可能对脑外伤小鼠脑水肿症状具有减轻作用，并改善其行为障碍可能，且显著优于机体本身抗氧化应激、抗损伤修复功能。脑损伤继发脑水肿可破坏周围脑组织及微血管，使局部脑血流量下降，产生大量炎症因子及氧自由基，加重脑损伤。氧化应激损伤在脑组织继发性损伤机制中发挥重要作用，其中一氧化氮(NO)、SOD、MDA等是重要氧化或抗氧化应激标志性物质[13]。汪刚等[14]研究报道，川穹提取物可通过提高血清SOD活性、降低MDA含量抑制氧化应激反应减轻心肌缺血损伤，可能与激活Nrf2信号通路有关。邹小蓉等[5]研究报道，FOR可降低缺血再灌注损伤大鼠NSS评分、提高大鼠学习记忆能力，改善脑组织形态、降低血清NO水平，发挥神经保护、抗氧化应激作用。本研究结果提示FOR具有抗氧化应激作用，FOR可能通过抑制氧化应激进而减轻脑外伤小鼠脑水肿及行为障碍。

Nrf2属于亮氨酸拉链家族，是一种具有抗氧化应激反应的重要转录因子。正常情况下，细胞浆内Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)与Nrf2形成复合物抑制Nrf2激活，发生氧化应激时，Nrf2脱离Keap1发生核转位，进入细胞核，进一步与抗氧化反应元件(antioxidant response elements，ARE)结合，发挥抗氧化应激作用。HO-1是Nrf2下游分子，是血红素分解代谢的限速酶，在脑内广泛表达，其水平升高亦可增强脑组织抗氧化损伤能力，抑制脑损伤[15-16]。韩遵华等[17]研究报道，依达拉奉可能通过促进HO-1信号通路活化减轻缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑水肿、脑梗死程度。Li等[18]研究报道，对脑外伤大鼠进行FOR预处理可通过激活Nrf2信号通路，上调miR-155和HO-1表达抑制氧化应激，对大鼠外伤性脑损伤具有神经保护作用。本研究发现，与Model组比较，FOR可呈剂量依赖性增加小鼠脑组织N-Nrf2、HO-1蛋白表达，降低C-Nrf2蛋白表达，且FOR中、高剂量效果显著优于EDA组，提示FOR可能通过促进Nrf2蛋白核移位，进而上调HO-1蛋白表达，抑制氧化应激反应，减轻脑外伤小鼠脑水肿，改善其行为障碍。

综上所述，FOR可通过促进Nrf2/HO-1通路激活，抑制氧化应激反应，减轻脑外伤小鼠脑水肿并改善其行为障碍。本研究虽然对脑外伤小鼠模型2 h、1 d、3 d分别设置亚组对照进行了研究，但每组只选择5只小鼠进行试验，可能数量较少，结果存在具有一定局限性，存在不足。后期需增加实验小鼠数量进一步深入探究。