ECMO通过TLR4/NF-κB通路对家兔延迟复苏失血性休克肠损伤的影响

于士昌，张璐芳，翟建宾，谭国良，李国雷，赵 亮

(1.河北省中医院 心胸外科，河北 石家庄050000;2.河北省卫生健康委员会综合监督服务中心 中医药卫生处，河北 石家庄050000；3.河北省中医院 外三科，河北 石家庄050000)

失血性休克是临床常见危重症，是临床中最为常见的死亡原因之一。既往研究表明，失血性休克随复苏时间的延长增加机体器官损伤程度，而在发生交通意外、自然灾害时，多数患者在休克早期不能及时复苏，导致救治难度大大增加[1-2]。机体在复苏期间，肠黏膜血管存在持续低灌流和收缩现象，最易导致肠道屏障作用消失，细菌异位，从而造成其他脏器继发性损伤[3]。体外膜肺(ECMO)是目前危重症患者救治的重要支持技术，既往研究证实[4-5]，ECMO技术可有效提高延迟复苏失血性休克兔的复苏成功率，改善休克再灌注后脏器损伤，但其对肠黏膜的影响及调控机制报道较少。为此，本研究通过建立延迟复苏失血性休克兔模型，并在常规复苏基础上引入ECMO技术，进一步观察ECMO对延迟复苏失血性休克兔肠损伤的影响及可能调控机制，为临床中延迟复苏失血性休克患者的救治提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

MP100型生理记录仪(美国Biopac公司)，三通接头(德国B.Brown公司)，动物膜肺(西安西京医疗用品有限公司)，HD325C型生物切片机(湖北医疗器械七厂)，7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 试药

乳酸钠林格注射液(华仁药业股份有限公司)，白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)，大鼠抗兔Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB p65(NF-κB p65)、claudin、闭锁蛋白(occludin)多抗(一抗，武汉博士德生物工程有限公司)，HRP标记的山羊抗大鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 实验动物

50只雄性新西兰大白兔，7月龄，体质量2.0-3 kg，购自第三军医大学实验动物中心[SYXK(渝)2017-0002]。单笼饲养，所有动物实验符合3R原则，实验过程遵循国家实验动物管理条例及国家实验动物管理实施细则。

1.4 延迟复苏兔模型建立及分组

50只新西兰大白兔禁食禁水12 h，随机留取10只为对照组，其余40只采用股动脉放血法制备延迟复苏兔模型[6]：经耳源静脉注射30 mg/kg的3%戊巴比妥那麻醉，仰卧位固定于手术台上，双侧腹股沟备皮、铺巾，剪开双侧股动脉皮肤，分离双侧股动脉后，用20号静脉穿刺针穿刺并固定穿刺针，右侧连接三通管用于放血和采血，并连接生理记录仪监测平均动脉压(MAP)，左侧进行输血和补液。以1 mL/kg·min速度从左侧股动脉放血，全血用肝素钠抗凝备用，MAP下降至40 mmHg时停止，输血或放血使MAP维持在35-40 mmHg，180 min后，36只存活兔随机分组：休克组、常规复苏组、ECMO复苏组和ECMO+TLR激动剂组，每组9只，对照组未进行放血，其余操作同前。

1.5 复苏方法

对照组和休克组：不进行任何复苏处理；常规复苏组：180 min后立即经颈静脉回输全血及两倍放血量的乳酸钠林格液进行常规复苏；ECMO复苏组：150 min时行颈静脉插管建立ECMO循环，180 min时进行常规复苏的同时进行ECMO转流复苏，60 min后停止复苏；ECMO+TLR激动剂组：150 min时行颈静脉插管建立ECMO循环，180 min时进行常规复苏的同时进行ECMO转流复苏，并经颈静脉注射5 mg/kg的LPS(溶于生理盐水)，60 min后停止复苏。

1.6 检测指标

1.6.1肠道屏障功能检测

复苏完毕，各组经右侧股动脉采血，静置分层后，4℃预冷离心机离心收集上层血清，采用分光光度计法测定血清二胺氧化酶(DAO)水平，用酶标仪检测436 nm波长处光密度(A)值。空气栓塞法处死各组兔，立即解剖，无菌获取肠系膜淋巴结、腹腔灌洗液、肝脏、肾脏、肺脏，放入细菌培养液，需氧条件下培养24 h，无氧条件下培养48 h，培养温度为35℃，获得阳性标本进行涂片鉴定，有大肠杆菌或类杆菌则记为阳性，以细菌培养阳性器官数占总培养器官数比例为细菌异位率[7]，即阳性器官数/(兔数×5)。

1.6.2回肠组织病理学观察

复苏毕，取各组距离盲肠5 cm处的回肠组织，用生理盐水轻轻冲洗表面，部分置于10%中性甲醛固定48 h，经酒精脱水、石蜡包埋后，制作厚度为4 μm的连续切片，每只兔回肠组织取5张切片，进行常规苏木精-伊红(HE)染色，于光学显微镜下观察回肠黏膜组织病理学变化。

1.6.3回肠组织中IL-6、TNF-α水平检测

剖腹取部分新鲜回肠组织，用PBS轻轻冲洗表面，加入1 mL PBS，匀浆后2500 r/min离心15 min(离心半径10 cm)，收集上清液采用ELISA试剂盒检测回肠组织中IL-6、TNF-α水平，严格参照试剂盒说明书操作，用酶标仪检测492 nm波长处A值，根据标准曲线计算待测炎症因子水平。

1.6.4回肠组织中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin mRNA表达检测

新鲜回肠组织用组织剪剪碎，采用Trizol法提取总RNA，反转录获得互补链cDNA，以之为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)，按照试剂盒说明书设定反应体系，反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性25 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，共42个循环。以β-actin为内参基因，以2-△△CT计算目的基因的相对表达强度。引物序列：TLR4：F:5′-CTGATGCTGATGCTGATGC-3′，R:5′-GTGATGCTAGCTGACGTA-3′;NF-κB p65:F:5′-ACTGATGCTCGTACTGATG-3′,R:5′-GAATGCTGCCTGATGCTCC-3′;claudin:F:5′-ACCTTGAAACTGATGCCG-3′,R:5′-GTGATGCCTGATGCTGAC-3′;occludin:F:5′-ATGATGCTGATGCTGACCACG-3′,R:5′-TAGCTGATGCTGATGCAGTCC-3′;β-actin:F:5′-TAGCGTGACTGTAGCTGAT-3′,R:5′-GTAGTAGCTCTGATGCTGA-3′。

1.6.5回肠组织中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin蛋白表达检测

将新鲜回肠组织放入液氮中研磨，加入细胞裂解液，于冰上裂解20 min，12 000 r/min离心10 min(离心半径12 cm)取上清液，BCA法进行蛋白定量，取待测蛋白与等量上样缓冲液混匀，于沸水中水浴10 min，再次离心取上清液，进行SDS-PAGE分离，经电转、封闭后，加入稀释一抗[TLR4、NF-κB p65(1∶500)，claudin、occludin(1∶400)]，4 ℃孵育过夜，加入稀释二抗(1∶5 000)，常温孵育1.5 h，电化学发光法进行显影，用凝胶成像系统扫描，Image J图像处理软件分析灰度值，待测蛋白相对表达量以条带灰度值与内参β-actin灰度值比值表示。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组回肠粘膜组织病理学改变

对照组肠黏膜形态无明显异常，休克组肠黏膜结构破坏，绒毛大量脱落，大量炎性细胞浸润及上皮细胞坏死；常规复苏组和ECMO组肠黏膜结构基本正常，ECMO组病变更轻，但仍可见部分炎性细胞浸润和上皮细胞水肿；ECMO+TLR4激动剂组较ECMO组病变加重，但较休克组轻，见图1。

图1 回肠黏膜组织病理学改变(HE×400)

2.2 各组肠道屏障功能比较与对照组比较，休克组血清DAO、细菌异位率较高(P<0.05)；与休克组比较，常规复苏组、ECMO复苏组及ECMO+TLR激动剂组血清DAO、细菌异位率均降低，其中ECMO复苏组低于常规复苏组和ECMO+TLR激动剂组，常规复苏组低于ECMO+TLR激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组肠道屏障功能比较

2.3 各组回肠组织中炎症因子水平比较

与对照组比较，休克组回肠组织中IL-6、TNF-α水平较高(P<0.05)；与休克组比较，常规复苏组、ECMO复苏组及ECMO+TLR激动剂组IL-6、TNF-α水平均降低，其中ECMO复苏组低于常规复苏组和ECMO+TLR激动剂组，常规复苏组低于ECMO+TLR激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组回肠组织中炎症因子水平比较

2.4 各组回肠组织中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin mRNA表达水平比较

与对照组比较，休克组TLR4、NF-κB p65 mRNA相对表达量较高，claudin、occludin mRNA相对表达量较低(P<0.05)；与休克组比较，常规复苏组、ECMO复苏组及ECMO+TLR激动剂组TLR4、NF-κB p65 mRNA相对表达量降低，其中ECMO复苏组低于常规复苏组和ECMO+TLR激动剂组，常规复苏组低于ECMO+TLR激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)；与休克组比较，常规复苏组、ECMO复苏组及ECMO+TLR激动剂组claudin、occludin mRNA相对表达量升高，其中ECMO复苏组高于常规复苏组和ECMO+TLR激动剂组，常规复苏组高于ECMO+TLR激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组回肠组织中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin mRNA相对表达量比较

2.5 各组回肠组织中TLR4、NF-κB p65、claudin、occludin蛋白表达水平比较

与对照组比较，休克组TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量较高，claudin、occludin蛋白相对表达量较低(P<0.05)；与休克组比较，常规复苏组、ECMO复苏组及ECMO+TLR激动剂组TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量降低，其中ECMO复苏组低于常规复苏组和ECMO+TLR激动剂组，常规复苏组低于ECMO+TLR激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)；与休克组比较，常规复苏组、ECMO复苏组及ECMO+TLR激动剂组claudin、occludin蛋白相对表达量升高，其中ECMO复苏组高于常规复苏组和ECMO+TLR激动剂组，常规复苏组高于ECMO+TLR激动剂组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05；与休克组比较，#P<0.05；与常规复苏组比较，△P<0.05；与ECMO复苏组比较，▲P<0.05。

3 讨论

自然灾害、交通意外、战争等是导致失血性休克的重要原因，由于交通或医疗条件的限制，休克患者很难获得早期复苏，导致复苏延迟，增加救治难度。既往研究显示，失血性休克延迟复苏可导致机体炎症反应加剧，且复苏时进一步造成脏器缺血再灌注损伤，导致并发症发生率升高[8-9]。失血性休克复苏后机体血压、心率等指标虽然已恢复，但为保证心脏、脑等重要脏器血流供应，肠道等器官血流反而出现进一步下降，继而引起多脏器继发性损伤[10]。探讨失血性休克延迟复苏期间小肠结构和功能损伤，并明确调控机制，对救治失血性休克延迟复苏患者尤为重要。

小肠失血再灌注后，分布于肠绒毛顶端的上皮细胞最先受损，肠道完整性和屏障功能发生障碍[11]。DAO是分布与小肠上层绒毛中的一种酶，DAO血清水平升高提示肠道屏障功能受损，当肠道屏障功能消失时，可导致肠道内细菌移位，引起肠源性感染，进一步增加肠源性促炎因子的释放[12-13]。本研究发现，休克组肠黏膜结构破坏严重，绒毛大量脱落，大量炎性细胞浸润及上皮细胞坏死，常规复苏组和ECMO组肠黏膜结构基本正常，ECMO组病变更轻；常规复苏组、ECMO复苏组血清DAO、细菌异位率及回肠组织中IL-6、TNF-α水平均低于休克组，且ECMO复苏组低于常规复苏组，提示ECMO可有效减轻失血性休克兔延迟复苏后肠损伤，改善肠黏膜屏障功能。

TLR4属于Ⅰ型跨膜蛋白，可通过直接或间接与病原体结合，触发机体天然防御系统[14]。细菌外膜蛋白进入机体后与细胞膜上受体结合形成复合物，TLR4激活，进而激活下游NF-κB p65进入细胞核，调控炎性介质TNF-α、IL-6的转录、翻译等过程，进而介导炎症反应[15-16]。既往研究表明[17]，TLR4/NF-κB炎性轴与肠损伤后细菌异位关系密切。本研究发现，常规复苏组、ECMO复苏组回肠组织中TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白相对表达量低于休克组，且ECMO复苏组低于常规复苏组，紧密连接蛋白claudin、occludin表达与上述结果相反，提示在常规复苏基础上引入ECMO技术可能通过抑制TLR4/NF-κB炎性轴，上调紧密连接蛋白的表达发挥改善肠道黏膜屏障功能。此外，本研究在ECMO复苏组基础上应用TLR4通路激活剂LPS干预，结果显示ECMO+TLR激动剂组血清DAO、细菌异位率、TLR4、NF-κB p65 mRNA和蛋白相对表达量高于ECMO组，claudin、occludin mRNA和蛋白相对表达量低于ECMO组，进一步支持ECMO复苏可通过TLR4/NF-κB炎性轴发挥减轻失血性休克兔延迟复苏后肠损伤的作用。

综上所述，在常规复苏基础上引入ECMO技术可有效减轻失血性休克兔延迟复苏后肠损伤，可能通过TLR4/NF-κB炎性轴发挥改善肠道屏障功能，进而减轻延迟复苏后的肠损伤，为临床失血性休克延迟复苏患者的救治提供治疗策略及理论基础。在进一步的研究中应延长复苏后观察时间，以探讨ECMO支持对失血性休克延迟复苏预后的影响。