犬猫铜绿假单胞菌耐药性研究

高一丁 ， 张伟伟 ， 邓晓昆 ， 王 权 ， 于咏兰

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京联宠国际检测中心 ， 北京 海淀 100089)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)，又名绿脓杆菌，感染犬、猫时最常见的是引起耳道炎及表皮或深部的脓皮症，也偶见尿路、呼吸道和血液感染等[1]。临床治疗P.aeruginosa感染难度较大，因其对多种临床常用抗生素，如氨苄西林、阿莫西林、头孢噻肟、头孢曲松有天然耐药性[2]。细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制主要为2种：作用靶点的突变与质粒介导耐药(Plasmid meditated quinolone resistance,PMQR)。作用靶点的突变被认为是细菌对氟喹诺酮耐药的主要机制，而质粒介导耐药目前被认为常出现在肠杆菌科细菌中。氟喹诺酮类药物作用于细菌的2种Ⅱ型拓扑异构酶，分别由gyrA、gyrB基因和parC、parE基因调控。当这些基因发生突变，导致氨基酸序列改变时，药物与作用靶点结合的紧密性被破坏导致药物失效[3]。来源于质粒可介导氟喹诺酮耐药的基因包括qnr基因家族，aac(6’)-Ib-cr基因、oqxAB基因和qepA基因，其介导氟喹诺酮耐药的机制包括保护药物作用位点、水解药物和主动将药物排出细菌体等[4]。

关于P.aeruginosa耐药性的研究，目前国内大多集中于经济动物和实验动物，少有关于犬、猫源P.aeruginosa的相关研究。氟喹诺酮类药物抗药谱广、吸收好、副作用低，被作为治疗细菌感染的常用药，并存在滥用现象。本试验收集52株来源于犬、猫的P.aeruginosa，通过琼脂稀释试验检测其耐药谱，通过PCR特异性扩增探索其对氟喹诺酮类药物的耐药基因，为犬、猫P.aeruginosa感染后的科学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 本试验检测P.aeruginosa共52株，采集于2017年12月—2019年1月，其中20株为北京联宠国际检测中心分离保存，32株为本实验室保存样品。其中皮肤源菌株17株，耳道源菌株18株，呼吸道菌株17株。52株菌株中，33株来源于犬，19株来源于猫。

1.2 试剂和仪器 抗生素标准品，购自北京索莱宝科技有限公司、上海陶素生化科技有限公司和中国食品药品检定研究院；MH(A)琼脂干粉，购自北京陆桥生物技术有限责任公司；质粒提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；碳酸氢钠、氢氧化钠、二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠，均购自国药集团化学试剂有限公司；PCR Mix、PCR Marker、核酸染料及TAE缓冲液等试剂，均购自北京康润诚业生物科技有限公司。试验中使用的引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成。主要试验仪器包括：海尔青岛股份有限公司HR40-IIA2生物安全柜，MCO-18AC三洋二氧化碳培养箱，北京六一生物科技有限公司DYY-6D 型电泳仪和Vetri 96 梯度基因扩增仪。

1.3 方法

1.3.1 菌株药敏试验 将保存好的菌株接种于血琼脂平板上，在37 ℃条件下过夜复苏获得纯化菌落。参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)-VET08标准所记录的琼脂稀释法测定菌株对左氧氟沙星、马波沙星、恩诺沙星、多西环素、庆大霉素、阿米卡星、头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。试验中各药物所需溶剂与助溶剂参考CLSI-VET08与2018版CLSI标准所述。

1.3.2 菌株氟喹诺酮耐药机制分析 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取所有菌株的基因组DNA作为Ⅱ型拓扑异构酶基因模板，并扩增目标序列。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃再延伸8 min。PCR扩增体系：模板4 μL，TaqMix 25 μL，ddH2O 17 μL，上下游引物各2 μL。各目标序列所用引物参照参考文献[3]进行设计，见表1。使用质粒提取试剂盒提取所有菌株的质粒DNA作为PMQR基因模板，并扩增目标序列。扩增条件：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃再延伸8 min。PCR体系:模板4 μL、TaqMix 25 μL、ddH2O 17 μL、上下游引物各2 μL。各目标序列所用引物参考文献[5]，见表1。配制2%琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物进行电泳鉴定，并将阳性产物送至测序公司测序，将所得序列与标准序列比对鉴定。

表1 各目标序列扩增引物Table 1 Amplifyication primers of each target sequences

2 结果

2.1 菌株药敏试验 药物琼脂平板上的P.aeruginosa以单菌落的形式生长，在低浓度药物琼脂平板上可见黄绿色或绿色色素扩散，质控菌对所有药物的MIC均在规定范围内，试验菌株对各抗生素的敏感率见表2。

表2 犬、猫铜绿假单胞菌药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of Pseudomonas aeruginosa in dogs and cats

2.2 菌株氟喹诺酮类药物耐药机制分析 52株P.aeruginosa中，均未检测出qnrA、qnrB、qnrS、qepA基因和oqxAB基因，共有19株菌株检测出aac(6’)-Ib基因，经与标准序列比对后，19条序列均为单一功能的氨基糖苷酰基转移酶，无介导氟喹诺酮耐药功能。经PCR特异性扩增后，52株菌株均扩增出了gyrA、gyrB、parC、parE基因序列，见表2。经与标准序列比对后发现，共9株菌株发生了GyrA氨基酸的替代；3株发生了ParC氨基酸的替代；5株发生了ParE氨基酸的替代；无菌株发生GyrB氨基酸的替代，见表3。采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，使用偏相关分析对GyrA、ParC、ParE氨基酸替换与氟喹诺酮类药物耐药结果进行差异显著性检验，结果发现本试验中，GyrA氨基酸替换(r=0.392，P=0.004)、ParC氨基酸替换(r=0.326，P=0.018)、ParE氨基酸替换(r=0.294，P=0.034)均与氟喹诺酮类药物耐药性呈低度相关。GyrA、GyrB、ParC、ParE 氨基酸替代与恩诺沙星、马波沙星、左氧氟沙星的 MIC的关系见表4。

表3 Ⅱ型拓扑异构酶的氨基酸替代结果Table 3 The amino acids alternation in type Ⅱ topoisomerase

表4 氨基酸替换与氟喹诺酮类药物最小抑菌浓度之间的关系Table 4 The relationship between amino acid alternation and fluoroquinolones MIC

3 讨论

本次药敏试验结果表明，所有菌株对头孢他啶与头孢吡肟最敏感，2种药物均只有1株菌株对其耐药，这与文献报道的世界范围内P.aeruginosa感染治疗中，头孢他啶与头孢吡肟均为对抗P.aeruginosa感染的首选用药[6]是吻合的。头孢吡肟是第4代头孢菌素类的代表药物，头孢他啶是第3代半合成药物，对多重耐药革兰阴性杆菌具有良好的疗效，建议选用头孢他啶与头孢吡肟作为P.aeruginosa感染时的首选用药。本试验中各菌株对氟喹诺酮类药物耐药率较高，分别为恩诺沙星19.2%、马波沙星30.8%和左氧氟沙星15.4%，这一结果与Rubin等[7]在2008年发现的该菌对恩诺沙星耐药率31%、马波沙星27%、左氧氟沙星16%接近。

氟喹诺酮类药物具有抗菌谱广、副作用小、易吸收等优点，其代表药物恩诺沙星(商品名拜有利)已经被广泛应用于犬、猫临床。在获得药敏检查结果之前，为了避免可能存在的多重耐药导致前期治疗失败，推荐选用氟喹诺酮类药物与β内酰胺类药物联合用药作为治疗方案。

碳青霉烯类药物被认为是治疗革兰阴性杆菌感染的最后一道防线，细菌对其耐药性的变化是耐药监测工作的重点。本次试验中，亚胺培南的耐药率为46.2%，2017年杨桐等[8]对全国范围内动物医院分离的细菌的耐药研究显示，P.aeruginosa对亚胺培南的耐药率为23.6%，远低于本次试验的结果。这可能与部分兽医盲目选择其作为首选药物有关。考虑到公共健康安全，建议加以密切关注。

Lin等[9]在2012年进行的试验中，P.aeruginosa对阿米卡星的耐药率为11.1%，庆大霉素的耐药率为14.8%，亚胺培南的耐药率为0，与本试验结果差距较大。但其阿米卡星和庆大霉素的MIC50分别为<4 μg/mL和4 μg/mL，MIC90分别为8 μg/mL和>128 μg/mL，庆大霉素的MIC90远高于折点值，说明庆大霉素可能不适用于P.aeruginosa的治疗。Lin等[9]试验中亚胺培南的MIC90为4 μg/mL，本试验中亚胺培南的MIC90为8 μg/mL，位于药物敏感范围内，可用于临床治疗。2008年Rubin等[7]的试验中阿米卡星和庆大霉素的耐药率为3%和7%，MIC50与MIC90均小于折点值，这种差异可能是由于样本来源的区域和时间不同，以及个体宿主差异所造成。

目前各种针对动物源的药敏试验中使用的耐药折点版本混乱，主要有CLSI兽医标准、CLSI人类临床标准和EUCAST欧洲临床标准3种，受药物动力学和药效学影响，各参考标准中不同菌株对不同物种的耐药折点均有差异，人类临床医学与兽医临床所使用的参考标准中的折点也有所不同，折点的改变可能导致药敏试验结果出现很大差异，所以对于兽医中未给出明确折点的药物，评估其抗菌能力应以临床治疗效果为主。

本次试验中未检测到任何PMQR基因，这也与目前已发表的一些结果相一致。目前研究认为，PMQR基因主要的携带者是肠杆菌科。然而随着时间发展，目前有少量研究报道了在假单胞菌属细菌中发现PMQR基因。2015年胡凡[10]从51株猪源和鸡源P.aeruginosa中分离到了7例aac(6’)-Ib-cr基因、5例qnrS基因以及3例qnrB基因。2018年Vingopoulou等[11]从78株犬中耳炎病例中采集到的P.aeruginosa中分离到了2例qnrA，2例qnrS和1例qnrB基因。

P.aeruginosa主要的GyrA与ParC替换位点与肠杆菌科相似，1999年Akasaka等[3]检测了150株耐左氧氟沙星P.aeruginosa的Ⅱ型拓扑异构酶突变情况，其中119株出现了GyrA的氨基酸替换，主要替换模式是第83位的Thr替换为Ile或Ala，第87位的Asp替换为Asn、Gly、Tyr；第27株出现GyrB的氨基酸替换，主要替换模式是第470位的Glu替换为Asp；第84株出现ParC的氨基酸替换，主要替换模式为第87位的Ser替换为Leu或Trp；13株出现ParE的氨基酸替换，其中包括第473位的Ala替换为Val和第459位的Glu替换为Val。本次试验中发现的各种氨基酸替换与该试验结果[3]部分一致。Vingopoulou等[11]和Thirumalmuthu等[12]分别从中耳炎和角膜炎样本中分离到的P.aeruginosa都发现了以GyrA中第83位由Thr替换为Ile，和ParC中第87位由Ser替换为Leu为主的氨基酸突变模式，Thirumalmuthu等[12]还发现了1例ParC中第752位氨基酸由Pro替换为Thr。

Akasaka等[3]证明，GyrB和ParE单独发生替换时，不会对菌株耐药性产生显著增强，而GyrA单独替换会显著增高菌株耐药性，当GyrA发生2处替换时菌株耐药性会更强，而当ParC与GyrA同时发生替换时，会使这个效应进一步增强。在本试验中(表4)，有3株菌株出现了GyrA替换表现了氟喹诺酮类的耐药，但仍有2株菌株出现了GryA的替换仍对药物敏感。受限于样本数量，本试验各菌株中GyrA均只出现1处替换，2株菌株同时出现了GyrA和ParC的替换但对药物的耐药性并无进一步提升；本次试验中1株菌株单独发生了ParC的替换后对3种氟喹诺酮类药物的耐药性出现超常地提高，超过了ParC和GyrA双替换的2株菌株；有2株菌株单独发生了ParE的突变，对氟喹诺酮的MIC都超过了耐药折点。总之，由于Ⅱ型拓扑异构酶基因突变致氨基酸替换进而导致P.aeruginosa耐药性改变是相当复杂的事件，需要积累更多的试验数据才能找到其规律。另外，本次试验中有9株未发生任何氨基酸突变的菌株也对所有氟喹诺酮类药物耐药，这说明试验菌株可能存在其他耐药机制的作用，如生物膜、主动外排系统、孔蛋白缺失等，需要进一步地研究来证实。

P.aeruginosa感染是犬、猫临床常见的传染性疾病，本研究犬、猫P.aeruginosa对抗生素药物耐药性的检测和氟喹诺酮类药物耐药机制的分析为临床犬、猫P.aeruginosa感染的防治提供了参考。