槲皮素通过FXR信号通路对胆汁淤积幼鼠的治疗作用及其对MDR3、MRP2、OATP2表达的调控研究

吕 歆，张香军，尚俊梅，胡新俊

（1.黄河三门峡医院消化内科，河南 三门峡 472000；2.黄河三门峡医院重症医学科，河南 三门峡 472000 3.河南科技大学第一附属消化内科，郑州 450000）

胆汁淤积症是多种原因所致的胆汁分泌及排泄障碍，多见于婴儿期[1]。目前临床以特殊饮食、药物及手术方式治疗胆汁淤积症，但整体疗效仍有较大的提升空间[2]。研究[3]认为，肝胆细胞膜有关转运蛋白表达异常、氧化应激、炎症损伤、肝细胞结构异常与胆汁淤积症发病密切相关。研究[4-6]发现，被子植物提取物槲皮素具有抗病毒、抗氧化应激及抗炎等多种生物活性，可用于非酒精性脂肪性肝炎、肝癌等治疗。目前关于槲皮素在胆汁淤积症中的治疗效果及相关机制的研究尚少。本研究通过建立胆汁淤积幼鼠模型，观察槲皮素对胆汁淤积的治疗作用，并探究相关信号通路的调控机制。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF 级雄性SD 幼鼠49 只，日龄21 d，体质量（80±20）g，购自华东师范大学[许可证号：SYXK（沪）2014-0006]。

1.2 主要试剂、仪器 槲皮素（湖北帝柏化工有限公司，纯度＞98%，粉末状），α-萘异硫氰酸酯（alphanaphthylisothi，ANIT）（山东摩尔化工有限公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海金畔生物科技有限公司），水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司），Trizol 试剂盒、Promega 试剂盒、Takara SYBR Green 荧光定量试剂盒（美国Santa Cruz 公司），BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司），兔抗鼠法尼醇X 受体（farnesoid X receptor，FXR）多抗、多药耐药蛋白3（multidrug resistance 3，MDR3）单抗、多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein2，MRP2）单抗、有机阴离子转运多肽亚型2（organic anion transporting polypeptides 2，OATP2）多抗（美国Abcam 公司）。UniCel DxC 800 Synchron 全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司），SM2010R切片机、EG1150 分体式包埋机（德国徕卡显微系统贸易公司），CX23 光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社），实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，QRT-PCR）仪、PE2400电泳仪、Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统（美国Bio-rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立、分组及干预 取60 只SPF 级雄性SD 幼鼠，自由进食及饮水，适应性喂养5 d 后随机抽取10 只设为正常组。其余50 只建立胆汁淤积模型[7]。以芝麻油将ANIT 稀释成质量分数1.6%的混合溶液，按幼鼠体质量50 mg/kg 于造模开始当天、第7 天、第14天、第21天灌胃（正常组同时间点灌胃等量芝麻油）。为保证药物充分、均匀吸收，灌胃前后6 h 均禁食不禁水。造模第22 天，腹主动脉取血，全自动生化分析仪检测血清谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyltranspeptidase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，如GGT 水平＞3 倍造模前水平，ALP 水平＞1.5 倍造模前水平，说明造模成功。将造模成功的39 只幼鼠随机分为模型组（9 只）、槲皮素低剂量组（10 只）、槲皮素中剂量组（10 只）、槲皮素高剂量组（10 只）。末次ANIT 灌胃后12 h，槲皮素低、中高剂量组分别采用20、40、80 mg/kg 体质量槲皮素灌胃（槲皮素溶解于0.2 mL 2% DMSO溶液），正常组与模型组均予2% DMSO 溶液灌胃，各组均按照10 mL/kg 体质量灌胃，每日1 次，连续4 周。

1.3.2 血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、ALP、GGT 水平测定 第2、3、4 周槲皮素灌胃后6 h，取2～3 mL 眼眶静脉丛血，静置20 min后以2 500 r/min 离心10 min（离心半径10 cm），分离血清，置于-80 ℃环境中备用。采用全自动生化分析仪及配套试剂测定血清ALT、ALP、GGT 水平。

1.3.3 肝组织病理变化观察 末次灌胃后6 h，所有幼鼠以10%水合氯醛按0.33 mL/100 g 体质量进行腹腔麻醉，剪开其腹腔，取肝脏右叶组织，每只幼鼠取材位置相同，采用10%中性甲醛溶液固定48 h，流水冲洗25 min 后梯度乙醇脱水，石蜡包埋后自然冷却，采用病理切片机制作成连续切片，厚度为4 μm，HE 染色，采用显微镜观察肝组织病理变化。

1.3.4 肝 组 织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相对表达量测定 采用QRT-PCR 法测定各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相对表达量。取各组60 mg 肝右叶组织，Trizol 法提取总RNA，经Nanodrop 系统测定浓度、纯度，260 nm 位置OD/280 nm 位置OD ＞1.8。定量后采用Promega 试剂盒反转录，获得cDNA，电泳、酶标仪定量，按Takara SYBR Green 荧光定量试剂盒说明书要求设定反应体系：SYBR Premix Ex Taq II 11.5 μL，ddH2O 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板1.5 μL，总体积25 μL。反应条件：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，重复42 个循环。以β-actin 为管家基因，2-△△Ct为目的基因相对表达量。所有实验重复3次，取平均值。各基因引物序列，见表1。

表1 各基因引物序列

1.3.5 肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量测定 采用Western blot 测定各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量。取各组60 mg 肝右叶组织，研磨器充分研磨，转移至离心管后与0.5 mL 细胞裂解液混合，冰上裂解，6 000 r/min离心20 min（离心半径8 cm），收集沉淀，经BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量，100 ℃水浴蛋白变性，取60 μg 等量上样，恒定电压下行5%～10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，转膜后加入5%脱脂奶粉封闭液封闭，室温下摇床孵育2 h，加入稀释一抗（1:1 000），4 ℃过夜，TBTS 洗膜3×15 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:10 000），常温孵育2 h，TBTS 洗膜3×15 min。电化学发光试剂暗室中显影，全自动凝胶成像系统扫描拍照，分析灰度值，以FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白灰度值/内参β-actin灰度值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0 分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，组内各时间点比较以重复测量方差分析检验，多组间计量资料以方差分析检验，两两样本以SNK-q检验分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察 正常组幼鼠入组时毛发柔顺、有光泽，活力充沛，进食、进水情况正常，尿色清亮，肝组织表面、肠管组织光滑红润；模型组幼鼠造模3周后毛发凌乱、松散、无光泽，精神不振，容易激惹，活动减少，进食量减少，尿色深黄或呈浓茶样改变，对光、声音刺激反应减弱，肝组织失去红润、光滑的外表，部分见黄色结节，肠管明显扩张。槲皮素3 个剂量组表现出与模型组类似症状，但程度均轻于模型组。

2.2 各组槲皮素灌胃后第2、3、4 周血清ALT、ALP、GGT 水平比较 ALT、ALP、GGT 组间、时间、交互比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，第2、3、4 周槲皮素低、中、高剂量组血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，但均高于正常组，槲皮素低剂量组高于槲皮素中、高剂量组，槲皮素中剂量组高于槲皮素高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与第2 周比较，槲皮素3 剂量组第3、4 周血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，与第3 周比较，槲皮素3 剂量组第4 周血清ALT、ALP、GGT 水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常组、模型组血清ALT、ALP、GGT 水平随时间延长无明显变化（P＞0.05）。见表2，表3，表4。

表2 各组各时间点血清ALT 水平比较（） （U/L）

表2 各组各时间点血清ALT 水平比较（） （U/L）

注：与正常组比较，## P ＜0.001；与模型组比较，△P ＜0.05；与槲皮素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与槲皮素中剂量组比较，□P ＜0.05

表3 各组各时间点血清ALP 水平比较（） （U/L）

表3 各组各时间点血清ALP 水平比较（） （U/L）

注：与正常组比较，## P ＜0.001；与模型组比较，△P ＜0.05；与槲皮素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与槲皮素中剂量组比较，□P ＜0.05

表4 各组各时间点血清GGT 水平比较（ ） （U/L）

表4 各组各时间点血清GGT 水平比较（ ） （U/L）

注：与正常组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.001；与模型组比较，△P ＜0.05；与槲皮素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与槲皮素中剂量组比较，□P ＜0.05

2.3 各组肝组织病理变化观察 正常组肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝小叶、汇管区无明显异常；模型组肝细胞发生弥漫脂肪变性及碎片状坏死，小胆管及汇管区纤维组织增生，且发现大量炎性细胞浸润；槲皮素3 个剂量组肝细胞发生脂肪变性数量减少，小胆管及汇管区纤维组织增生减轻，炎性细胞浸润减少，其中槲皮素高剂量组减轻最为明显。见图1。

图1 各组肝组织病理变化（HE 染色，×200）

2.4 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相对表达量比较 FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，槲皮素低、中、高剂量组FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相对表达量均升高，但均低于正常组，槲皮素低剂量组低于槲皮素中、高剂量组，槲皮素中剂量组低于槲皮素高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5。2.5 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量比较 FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，槲皮素低、中、高剂量组FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量均升高，但均低于正常组，槲皮素低剂量组低于槲皮素中、高剂量组，槲皮素中剂量组低于槲皮素高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表6、图2。

表5 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相对表达量比较（）

表5 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 相对表达量比较（）

注：与正常组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.001；与模型组比较，△△P ＜0.001；与槲皮素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与槲皮素中剂量组比较，□P ＜0.05

表6 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量（）

表6 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白相对表达量（）

注：与正常组比较，## P ＜0.001；与模型组比较，△△P ＜0.001；与槲皮素低剂量组比较，▲P ＜0.05；与槲皮素中剂量组比较，□P ＜0.05

图2 各组肝组织FXR、MDR3、MRP2、OATP2 蛋白表达

3 讨论

胆汁淤积病因多样，研究[8-9]认为病理性黄疸史、巩膜黄染史、母乳喂养等均为其发生的危险因素。胆汁淤积发病机制较为复杂，目前临床尚未达成一致，胆汁形成功能性缺陷、肝窦基侧膜及毛细胆管膜变化、肝细胞骨架变化、紧密连接损伤、肝中胆管或毛细胆管阻塞等具有较高的认可度[10-11]。研究[12-13]认为使用ANIT 构建胆汁淤积模型时导致的肝脏生化改变、病理损伤与人类相似，且与氧化应激反应密切相关。目前临床治疗胆汁淤积时通常在处理原发性疾病的基础上加用糖皮质激素口服，但用药周期长，且易导致免疫力降低、水肿等不良反应，家属接受度低。

本研究发现，槲皮素灌胃后第2、3、4 周槲皮素低、中、高剂量组血清ALT、ALP、GGT 水平均低于模型组，且随着槲皮素使用剂量的增加及灌胃时间的延长，槲皮素3 个剂量组血清ALT、ALP、GGT 水平逐渐降低，提示槲皮素可改善胆汁淤积幼鼠肝功能；通过HE染色观察发现，槲皮素干预后肝细胞弥漫脂肪变性及碎片状坏死，小胆管及汇管区纤维组织增生，大量炎性细胞浸润等病理变化较模型组明显减轻，其中槲皮素高剂量组减轻最为明显，提示槲皮素可减轻胆汁淤积幼鼠肝组织病理损伤。乌吉木等[14]使用分子对接技术研究红花抗胆汁淤积作用机制时发现，红花提取物之一槲皮素可作用于胆汁淤积2 个以上治疗靶点，从而调节胆红素与胆汁酸代谢。本研究采用槲皮素干预胆汁淤积幼鼠后，血清ALT、ALP、GGT 水平显著降低，且可减少肝细胞坏死、组织增生及炎性细胞浸润，表明槲皮素治疗胆汁淤积可改善幼鼠肝功能及肝组织病理变化。

FXR 属激素核受体超家族成员，主要集中在肠、肝脏等具有胆汁酸代谢功能的组织器官中。研究[15]发现，胆汁酸是FXR 天然的内源性配体，可激动FXR，从而对自身合成、转运、代谢进行负反馈调节。研究[16]发现，FXR 激动剂GW4064 可纠正胆汁酸代谢异常，减轻肝毒性。MDR3、MRP2、OATP2 是FXR下游调控因子。MDR3主要表达于肝细胞毛细胆管膜，负责胆固醇与胆汁酸形成的微胶粒的转运，避免胆道系统损伤。研究[17]显示，MDR3 基因敲除的小鼠可发展至肝硬化、胆汁淤积症、胆石症等进行性肝脏疾病。MRP2 位于染色体10C24，是转运结合型胆红素的重要基因，参与肝细胞中物质分布的调整。研究[18]认为，FXR/RXR 异二聚体可结合MRP2 启动子中雌激素受体，从而诱导MRP2 表达上调。OATP2 表达于肝细胞基底膜外侧，包含700 个左右氨基酸，通过钠离子依赖性跨膜转运机制易化胆红素、胆汁酸等物质的跨膜转运。OATP2 功能缺陷将导致胆红素难以转运至肝脏从而积聚于体内。FXR 可通过调节肝细胞核因子d-LST-1 活性从而调控OATP 家族成员表达，参与胆汁淤积症发生与发展。上述研究均说明，FXR 介导的MDR3、MRP2、OATP2 胆汁酸代谢中具有重要作用。本研究采用不同剂量槲皮素干预胆汁淤积幼鼠模型后，FXR、MDR3、MRP2、OATP2 mRNA 及蛋白相对表达量均高于模型组，提示槲皮素可能通过上调FXR、MDR3、MRP2、OATP2 表达，发挥调整胆红素、胆汁酸转运作用。

综上所述，槲皮素可改善胆汁淤积幼鼠肝功能，减轻肝组织病理变化，推测其作用机制可能与激活FXR 信号通路，上调MDR3、MRP2、OATP2 表达有关。FXR 信号通路作为槲皮素治疗胆汁淤积幼鼠的信号调控通路，可为槲皮素相关药物的研制及临床应用提供理论支持。