左旋紫草素通过减轻坏死性凋亡抑制高糖心肌细胞炎症的作用研究*

邓凯文，肖雯婧，刘瑞杰，钟沁月，呼永河，侯 君

西部战区总医院 药剂科(成都 610083)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由糖尿病引起的以左室舒张功能受损和心功能不全为主要临床表现的心肌病变，与炎症密切相关[1-3]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等炎症细胞因子具有全身性和心脏局部效应，在DCM发生发展中扮演重要角色[4-6]。传统中医药在治疗和预防糖尿病相关并发症上具有悠久历史，在临床上广泛使用的紫草是一种具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖等多种药理作用的传统中药[7-8]。左旋紫草素是从传统中药紫草中提取出的萘醌类色素，具有脂溶性极强的特点。研究[9]发现，左旋紫草素可抑制由脂多糖(LPS)刺激的TNF-α、IL-1β和IL-6表达；研究[10]表明，左旋紫草素可明显改善异丙肾上腺素建立的小鼠心脏模型功能，减少心肌纤维化，抑制炎症，减少凋亡。然而，左旋紫草素是否能够减轻高糖对心肌细胞的坏死性凋亡，抑制心肌细胞炎症，尚未见报道。坏死性凋亡既有细胞坏死的形态学改变，又有凋亡存在的规律性调控作用机制[11]，是一种非凋亡性的程序性死亡，在一定程度上参与高血糖引起的心肌细胞炎症损伤，可能是DCM发生的重要病理生理机制[12]。因此，本研究以高糖损伤H9C2心肌细胞模型为基础，该模型被广泛应用于体外模拟DCM，简单易行，旨在探讨左旋紫草素能否通过减轻坏死性凋亡，抑制高糖引起的心肌细胞炎症损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 低糖DMEM培养基、高糖DMEM 培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；左旋紫草素、CCK8试剂盒及2，7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)购于美国Sigma 公司；TNF-α, IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒购于武汉博士德公司； Cleaved Caspase-3抗体、Cleaved PARP抗体、GAPDH 抗体、BCA 蛋白定量试剂盒购于美国Cell Signaling Technology公司；荧光二抗购于美国Invitrogen公司；Hoechst 33258购于美国赛默飞公司；大鼠心肌H9C2细胞株购于成都湖畔生物科技有限公司。

1.1.2 仪器 激光共聚焦显微镜(美国Leica公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，电泳仪、转膜仪(美国 Bio-Rad公司)，分光光度仪(上海天普)。

1.1.3 细胞系 大鼠H9C2心肌细胞系购于中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H9C2细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2细胞培养箱中，恒温37 ℃培养。使用胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。将培养的H9C2心肌细胞随机分为5组：正常糖对照组(5.5 mmol/L葡萄糖，处理心肌细胞24 h)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖，处理心肌细胞24 h)、高糖+左旋紫草素低、中、高浓度组(25、50、100 μmol/L分别作用心肌细胞30 min，撤去，PBS 洗2 次，接着用30 mmol/L葡萄糖处理24 h)。

1.2.2 CCK8检测活性 以5×103个细胞/孔接种于96孔板，分组处理，每组设6个复孔，培养24 h 后，每孔加入20 μL CCK8 试剂，孵育2 h 后，酶标仪450 nm 测定吸光度。取5孔A值的平均数，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(%) =处理组A值/对照组A值×100%。实验重复5次。

1.2.3 细胞内活性氧(ROS)水平测定 按照浓度1∶1 000用无血清培养基稀释DCFH-DA，0.25%胰酶消化，PBS 洗涤细胞后，用DCFH-DA 溶液重悬细胞加入，37 ℃孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3 遍，激光共聚焦检测ROS水平，Image pro plus 5.0计数。

1.2.4 ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6 表达 严格按照说明书进行，最后反应液在450 nm 波长下测定光密度(OD) 值。

1.2.5 蛋白质印迹技术检测凋亡相关蛋白表达 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA测定蛋白质浓度，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE 电泳，继而转印到PVDF 膜，脱脂奶粉封闭后1 h，分别以Cleaved Caspase-3 抗体、Cleaved PARP抗体、GAPDH抗体孵育过夜后，二抗孵育1 h，ECL 化学发光显影。

1.2.6 Hoechst 33258核染色检测细胞凋亡 将H9C2心肌细胞接种于24 孔培养板中，在细胞生长到占培养孔面积约80%时，按各分组处理后，用PBS 冲洗3 次，然后用4%多聚甲醛于4 ℃固定10 min，加入含5 mg /L Hoechst 33258试剂，于37 ℃孵育30 min，在荧光显微镜下照相，鉴别正常的心肌细胞和凋亡的心肌细胞，随机选取视野在荧光显微镜下拍照，实验重复5 次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 左旋紫草素对高糖引起心肌细胞毒性的影响

CCK8实验结果表明，高糖处理H9C2心肌细胞24 h，可明显诱导细胞毒性，使心肌细胞存活率明显降低，与正常糖对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。应用左旋紫草素预处理心肌细胞30 min，能明显降低高糖引起的细胞毒性，使心肌细胞存活率升高，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

图1 各组H9C2心肌细胞存活率

2.2 左旋紫草素对炎症因子表达的影响

ELISA检测结果显示，较正常糖对照组，高糖组中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的产生明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比较，左旋紫草素预处理组中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达下降，呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 ELISA 测定炎症细胞因子表达

2.3 左旋紫草素对高糖引起心肌细胞氧化应激反应的影响

高糖作用于心肌细胞可使氧化应激反应增强，荧光信号MFI增加，与正常糖对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。左旋紫草素预处理心肌细胞30 min 可使ROS生成降低，呈剂量依赖性，与高糖组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 各组H9C2心肌细胞ROS表达水平

2.4 左旋紫草素对高糖引起心肌细胞凋亡的影响

Hoechst核染色结果表明，正常糖培养的H9C2心肌细胞染色质分布均匀，呈弥散均匀低密度蓝色荧光。高糖培养心肌细胞24 h后，胞核固缩致密呈高密度颗粒荧光，与正常糖对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与高糖组比较，应用左旋紫草素预处理心肌细胞30 min，能明显地减少高糖诱导的凋亡细胞数量，荧光密度降低，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05) (图3)。

图3 各组H9C2心肌细胞凋亡检测

2.5 左旋紫草素对坏死性凋亡蛋白表达的影响

蛋白质印迹技术结果表明，高糖处理心肌细胞24 h能明显增加Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP蛋白水平(P<0.05)；应用左旋紫草素预处理心肌细胞30 min能使Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP的蛋白水平明显减少，呈剂量依赖性，与高糖组比较，差异有统计学意义(P<0.05) (图4)。

图4 各组及左旋紫草素预处理组H9C2心肌细胞坏死性凋亡蛋白表达

3 讨论

DCM是由糖尿病引起的特殊性心肌病，发病率较高，危害性较大，是糖尿病患者的主要心脏并发症之一。DCM引起的氧化应激在诱导炎症反应中起着重要作用[13-14]。坏死性凋亡是一种不依赖半胱氨酸蛋白酶家族调控的程序性细胞死亡方式，它兼具坏死和凋亡的双重特性，其研究主要集中在与其密切相关的肿瘤靶向治疗和心血管疾病治疗中，是目前的研究热点之一[15]，但坏死性凋亡在DCM中是否表达及其作用机制还不清楚。

本研究观察到，高糖引起心肌细胞炎症的同时，可增加氧化应激水平，进一步证实高糖可诱发心肌细胞坏死性凋亡，提示坏死性凋亡是高糖诱导心肌损伤的一个重要原因。左旋紫草素预处理高糖H9C2心肌细胞，能减轻高糖对心肌细胞的毒性、氧化应激和炎症水平，结果表明，左旋紫草素在抑制坏死性凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和Cleaved PARP表达上调的同时，还能减轻心肌细胞炎症损伤，使细胞存活率升高，降低ROS 生成，减轻受损的心肌细胞氧自由基清除能力，且呈剂量依赖性。

综上所述，左旋紫草素通过抑制坏死性凋亡蛋白的表达，减轻高糖所致心肌细胞坏死性凋亡和氧化应激，发挥对DCM的抗炎作用。但左旋紫草素如何调控信号通路、如何减轻心肌细胞坏死性凋亡的机制，尚有待进一步深入研究。由此提示，左旋紫草素的抗坏死性凋亡效应可能是其在高糖环境下抗炎作用的新机制，上述结果为DCM治疗提供了新的实验依据。