基于分子网络技术研究丹参-川芎治疗心肌梗死的作用机制

随着生活节奏的加快及老龄化社会的到来，冠心病危险因素发病率呈上升趋势，冠心病流行日益严峻。我国心血管病患病率持续上升，目前，冠心病病人约有1 100万例，心肌梗死是最严重的心血管疾病之一，2016年城市死亡率为58.69/10万，农村为74.72/10万[1]。预计我国未来将新增2 100万人急性冠状动脉事件，可造成700万人心源性死亡[2]。心肌梗死是冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂引起的血栓性阻塞，又因急性心肌缺血可致心肌损伤或坏死。临床典型表现为心前区压榨性疼痛，伴大汗及濒死感等。2014年专家共识中指出：心肌梗死为本虚标实之证，标实包括寒凝、气滞、血瘀、痰浊[3]，血瘀为标实之首，占33.42%，气滞血瘀证为心肌梗死主要的证型之一[4]，中医治则当以行气活血祛瘀为主，兼顾他症。

丹参味苦，微寒，善治血分，活血祛瘀，可用于胸痹心痛，有“一味丹参，功同四物”之说。川芎辛温行散走窜，入血走气，功善行气活血，通经止痛，走而不守，治血瘀气滞闭阻等诸痛，誉为“血中之气药”。现代药理研究发现，丹参具有抗心肌缺血、抑制左心室肥厚、扩张血管及抗动脉粥样硬化、抗血栓、改善微循环和促进组织的修复与再生等作用[5]。川芎可以抑制氧自由基释放、有效改善心肌缺血、调节心律、扩张血管、增加冠状动脉血流量[6]。丹参-川芎是临床常用配伍药对，已是中医临床活血化瘀类方剂和制剂的核心配伍[7]。二者相辅相成，共奏活血化瘀、通心养脉之功，可以增加心肌供血，辅助心肌梗死治疗，改善预后。目前，已开发多种疏通心脉的中成药(包含丹参、川芎)，如：脑心通胶囊、血栓心脉宁片，治疗冠心病临床效果显著[8-9]。网络药理学是中药研究的热门方法之一，通过多个数据库的数据整合以及软件建模，获得药物活性成分、靶标、疾病等信息；以构建分子网络展示药物与疾病的关系。从整体角度探索药物与疾病间的关联性，强调从“单靶标”向“网络靶标”研究模式转变[10]。

关于丹参、川芎单味药的药理、药效研究较多，但关于丹参-川芎作为药对联合网络药理学技术探究药效机制的报道较少。本研究通过网络药理学技术，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，探索丹参-川芎药物活性成分、潜在治疗靶点和作用机制，阐述丹参-川芎治疗心肌梗死的科学内涵，为行气活血代表药对丹参-川芎的临床应用和科研提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 丹参-川芎治疗心肌梗死的网络药理学研究思路(见图1)

图1 研究思路示意图

1.2 中药活性成分及作用靶点筛选 利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)，设置口服生物利用度(OB)>30%、类药性(OL)>0.18作为筛选条件[11]，分别以“丹参”“川芎”为关键检索词，获得2味药物的有效活性成分及对应的靶点信息，并利用UniProt数据库(http： //www.uniprot.org)中的UniProtKB搜索，对靶点进行标准化处理，设置背景为“Homo sapiens”，得到所有靶点的“official gene symbol”。

1.3 疾病靶点筛选 运用GeneCards数据库(http：//www.genecards.org/)和OMIM数据库(http：//www.omim.org/)，以“myocardial infarction”为检索词，获得心肌梗死相关的疾病靶点。

1.4 生成交集靶点 将丹参、川芎的有效化合物对应的靶点与疾病靶点进行交集，并去重处理，生成交集靶点。将交集靶点导入至Venny 2.1.0 (http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/Index.html)，通过在线工具绘制交集靶点的韦恩图，确定交集靶点的靶向关系。

1.5 交集靶蛋白相互作用(PPI)网络的构建与拓扑分析 运用STRING数据库，导入交集靶点蛋白，限定物种为“homo sapiens”，设置最低相互作用阈值为“medium confidence”为0.7，隐藏网络中未连接的节点，其余参数保持默认设置，蛋白质交互关系的结果以TSV格式导出。将TSV格式转化为csv格式，并导入Cytoscape 3.7.2软件中，进行“network analyzer”拓扑分析，按照“degree”“betweenness centraliy”筛选出20个关键靶点信息。网络图以PNG格式下载，其中网络连线的粗细代表相互作用的强弱，靶点的自由度值表示相互作用的靶点个数。

1.6 活性成分与关键靶点的网络构建 将筛选出来的20个关键靶点与对应的活性成分导入Cytoscape 3.7.2软件中，形成可视化的“活性成分-关键靶点-疾病”关系网络图。网络中的节点为药物的活性成分或关键靶点，边代表二者的相互关系。

1.7 基因本体(GO)生物过程富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将中药有效成分的靶点与疾病靶点的交集靶点，导入DAVID6.8数据平台(http：//david.nciferf.gov/)进行GO分析及KEGG通路分析，富集结果下载并转化为csv格式。设定P<0.01，KEGG通路分析结果，再参照KEGG数据库(https：//www.kegg.jp/)进行在线查验富集通路结果，利用ImageGP在线绘图平台(http：//www.ehbio.com/ImageGP/)，绘制KEGG通路气泡图，以气泡图的形式输出。

2 结 果

2.1 中药有效活性成分及对应的靶点筛选 根据TCMSP平台，以OB和DL的界定值，本研究纳入72个活性成分，其中丹参和川芎的活性成分分别为65个、7个；根据OB值列举前10个(见表1)。对上述化合物进行靶点筛选，并经Uniprot数据库将预测靶点蛋白转换为基因名，共有197个。

表1 丹参-川芎药对中OB值居前10位的化合物基本信息

2.2 疾病靶点及交集靶点筛选 通过GeneCards数据库、OMIM数据库，筛选出心肌梗死相关的靶点2 923个。疾病靶点与丹参、川芎活性成分靶点交集后，获得靶点91个，三者的共同靶点有23个。将疾病靶点与中药化合物靶点导入至Venny 2.1.0，在线工具绘制交集靶点的韦恩图(见图2)。

图2 丹参、川芎有效成分与心肌梗死的交集靶点

2.3 PPI网络的构建及关键靶点筛选 将丹参-川芎药对治疗心肌梗死的潜在作用靶蛋白导入至STRING数据库，进行PPI网络构建(见图3)。该网络中有节点83个、边420条，其中紫色线代表经过实验验证的蛋白间相互作用，浅蓝色线代表从数据库中获得的蛋白间相互作用。将TSV格式转化为csv格式，并导入Cytoscape 3.7.2软件中，进行“network analyzer”拓扑分析，按照“degree”“betweenness centraliy”筛选出20个关键靶点信息。分析PPI网络中拓扑学参数，以自由度按降序排列，筛选出前20位的靶蛋白，自由度越大，说明靶点与更多的靶标存在靶向关系，在网络中作用越重要；其中自由度最大的靶点为TP53，其自由度值为35(见表2)。

图3 丹参-川芎药对治疗心肌梗死的靶蛋白相互作用网络图

表2 20个关键靶点信息

2.4 “药物-活性成分-关键靶点-疾病”的网络构建 使用Cytoscape 3.7.2软件，构建活性成分-疾病的关键靶点网络关系(见图4)，该网络中节点数为79个、边数201条。

2.5 GO生物学过程分析 将91个基因靶点进行GO生物学过程分析，利用DAVID6.8数据库平台，设定显著性程度P<0.01，筛选273个富集结果。按照P值大小升序排列，选取前20位功能信息以部分展示(见表3)。丹参-川芎药对治疗心肌梗死的作用靶点与多个生物学过程相关，基因功能主要富集在药物反应、调控细胞增殖、调控凋亡过程、调节一氧化氮生物合成过程、调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录和衰老等。

2.6 KEGG通路分析 将91个基因靶点进行KEGG通路分析，利用DAVID6.8数据库平台，设定显著性程度P<0.01，筛选出70条，按照P值大小升序排列，选取前20条通路信息以部分展示(见图5)，其中主要富集在PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路等信号通路。说明丹参-川芎药对可通过多条信号通路，协同发挥作用。

(续表)

图5 丹参-川芎治疗心肌梗死作用靶点参与的信号通路富集信息气泡图

3 讨 论

心肌梗死归属中医学“真心痛”“胸痹”范畴。真心痛多由于年老机体渐变，过于劳倦、情志过度、饮食肥甘厚腻等引起，致痰瘀渐生，相互胶结，心脉阻滞，心系受损，不通则通[12-13]；其典型临床表现为胸骨后或心前区剧烈疼痛，甚至胸痛彻背、背痛彻心，病死率高[14]，正如《灵枢·厥病》所言：“真心痛，手足青至节，心痛甚，旦发夕死，夕发旦死”。心肌梗死的中医学病因病机多归纳为本虚标实，标实以血瘀、痰浊、寒凝、气滞多见，其中“瘀阻血脉”往往贯穿于冠心病发病的整个过程，“瘀滞内结之血”表现为血液流变性异常、血栓形成及冠状动脉管腔狭窄[15]。“气为血帅”，心肌梗死治以活血祛瘀，行气以祛血分之滞，临床中丹参、川芎相伍为常用药对。

丹参-川芎共同活性成分主要有木犀草素、丹参酮ⅡA、丹参新酮、隐丹参酮等。有研究表明，木犀草素通过丝裂原活化蛋白激酶/NF-κB通路，可减轻缺血诱导的心肌炎性反应[16]。丹参酮ⅡA是丹参重要的脂溶性成分之一，可以调控Notch信号通路，减轻心肌缺血/再灌注损伤，同时参与调节血脂、增加钙离子内流、抗血小板聚集、降低血液黏稠度、保护心肌、扩张冠状动脉、清除氧自由基、抗氧化等多种药理作用[17-19]。丹参新酮能够抑制胶原GPVI信号通路的部分关键蛋白的磷酸化水平，主要包含PLCγ2/PKC/MAPK和PI3K/Akt/GSK3β信号通路以及αⅡbβ3介导的Src-FAK信号分子，抑制血小板膜表面 p-selectin 表达和ATP释放，从而抑制血小板的释放功能，达到抗血栓形成[20]。隐丹参酮可以通过抑制STAT3缓解1型糖尿病大鼠的心肌纤维化[21]，抑制钙超载、增加内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化，增加一氧化氮(NO)含量，扩张血管，以降低心肌缺血损伤[22-23]。

通过构建交集靶基因PPI网络，获得PPI网络核心靶基因，其中TP53、AKT1、JUN、IL6、CCND1和PTGS2等。GO生物学过程富集分析主要集中在药物反应、调控细胞增殖、调控凋亡过程、调节一氧化氮生物合成过程、调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录和衰老等。这些基本生物过程及功能体现在丹参-川芎活性成分调节对应靶基因和具体通路过程上。关于KEGG通路富集，主要包括PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡等信号通路。PI3K/Akt是调节心脏功能的一条重要的信号转导通路，参与心肌细胞凋亡、重构心室，诱导炎症细胞的聚集促进炎症反应，加速动脉粥样硬化的进展[24-26]。HIF-1α是HIF-1信号通路中重要的核转录因子，也是PI3K-Akt的下游分子，涉及血管收缩控制、血管新生、红细胞生成、细胞增殖和存活、能量代谢、细胞凋亡等过程[27-28]。肿瘤坏死因子通路中的TNF-α通过释放血小板源性生长因子，致使血小板数量增多，促进血栓形成；并且可提高心肌细胞间黏附分子的表达，增加心肌细胞和中性粒细胞的黏附作用，导致心肌细胞死亡和心肌功能障碍，进一步加重炎症反应[29-30]。丹参、川芎二者合用，符合行气活血的治则，达到祛心脉瘀滞作用。丹参、川芎可以通过以多成分、多靶点协同调控，发挥对心肌梗死的治疗作用。

本研究基于分子网络技术验证了丹参-川芎治疗心肌梗死的理论依据，期待为丹参-川芎作为善行气活血之常用配伍应用于心肌梗死治疗。基于网络药理学分析得到的活性成分与靶基因存在相关性，但不能明确活性成分对靶基因调控关系及药物、靶标、疾病之间的作用强度差异。中药的活性成分与靶基因相互作用是通过计算机模拟获得，仍需要后期进一步实验验证。