参连复脉颗粒对自发性高血压大鼠血清TNF-α、IL-6及心房颤动易感性的影响

马 征1，崔晓云2，万 洁2，高 群，曲信彦1，李 星1，蔡 芸1，李 岩2，林 谦

心房颤动是临床常见的心律失常类型之一。高血压是造成心房颤动疾病负担最主要的原因，社区动脉粥样硬化风险(atherosclerosis risk in communities，ARIC)研究显示有超过1/5的心房颤动可归因于高血压[1]。高血压可通过多种途径导致心房颤动的发生和发展，其一方面会造成左房不均匀扩张，引起心房结构重构，另一方面可通过激活炎症反应，促进心房纤维化，导致更高的心房颤动发生率[2]。近些年，越来越多的证据表明炎症在心房颤动的发生和维持中起着重要作用，心房的电生理和结构特性都受到炎症的严重影响[3]。本研究采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)为模型，通过中药参连复脉颗粒进行干预，旨在观察参连复脉颗粒对高血压大鼠炎症反应和心房颤动易感性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级健康雄性SHR 60只，SPF级健康雄性正常血压京都威斯特大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)12只，体质量(360±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006，饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房。

1.2 主要试剂与药品 参连复脉方，组方：党参5 g，丹参5 g，黄连3 g，法半夏2.5 g，赤芍3 g，川芎3 g，鬼箭羽3 g，白芍3 g，远志3 g，酸枣仁5 g，炙甘草5 g。北京中医药大学东方医院院内制剂(批准专利号 201310303390.5)，由北京中医药大学中药学院将每剂参连复脉方生药材经过水提、醇提、干燥及颗粒成型工艺加工后制得18 g浸膏粉颗粒剂以使用。氯沙坦钾片(杭州默沙东制药有限公司，批号H2000037)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号 20151023)，血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α，Andy Gene公司，批号20200107a)，白介素-6(IL-6，Andy Gene公司，批号20200106L)。

1.3 主要仪器 Powerlab多导生理记录仪(澳大利亚 ADInstruments公司)；离心机(Centrifuge 5415D 型，德国 Eppendorf 公司)；智能血压计(Softron公司，日本)。

1.4 分组及给药方法 60只24周龄雄性SHR按照随机数字表法分为高血压模型组、氯沙坦钾组(西药组)、参连复脉颗粒低剂量组(低剂量组)、参连复脉颗粒中剂量组(中剂量组)、参连复脉颗粒高剂量组(高剂量组)，每组12只，另12只24周龄雄性WKY大鼠为正常对照组，共6组。西药组将氯沙坦钾片溶解于0.9%氯化钠溶液中按照4.5 mg/(kg·d)灌胃；中药低剂量组、中剂量组、高剂量组将中药参连复脉颗粒溶于0.9%氯化钠溶液中，分别按照0.81 g/(kg·d)、1.62 g/(kg·d)、3.24 g/(kg·d)进行灌胃；模型组和正常对照组给予等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃。以上均按照1 mL/100 g灌胃，共进行4周。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 血压、心率的测量 采用智能血压计(Softron公司，日本)，在鼠尾根部进行测量，测量收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)以及心率(heart rate，HR)。每只大鼠重复测量3次，取平均值。

1.5.2 血清TNF-α、IL-6检测 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血2～3 mL室温静置约30 min后放入离心机中，在4 ℃，3 000 r/min下离心10 min。分离血清后分装，放入-80 ℃冰箱冷冻待测，其间避免反复冻融，采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定试剂盒，按照试剂盒说明书测定TNF-α、IL-6。

1.5.3 电生理检测 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉、固定后，给动物行气管插管并连接呼吸机辅助呼吸，连续检测心电图(ECG)Ⅱ导联，于左侧第三肋骨处开胸，打开心包后将起搏电极接至右心房游离壁，连接Powerlab多导生理记录仪，将记录电极接至左心房游离壁，记录电极固定于左房电位波振幅高于心室波的位置，同步记录体表心电图及左房心电图心房波(A 波)。检查内容：①P波时限、PR间期测量，心电信号显示速度为200 mm/s，测量体表心电图Ⅱ导联中最长的P波时限和 PR 间期；②心房有效不应期(atrial effective refractory period，AERP)，S1S2刺激，以2倍的有效夺获心房的电压阈值作为输出电压，脉宽2 ms，在8个S1S1刺激的基础上加发1个S2期前刺激，基础周长选择150 ms及120 ms，S2自100 ms递减5 ms至心房不应期，AERP未能夺获心房的最长S1S2间期，重复3次，取平均值；③诱发心房颤动，采用心房burst刺激，2倍阈值刺激输出，刺激周长为20 ms，脉宽为2.5 ms，连续刺激5 s，重复3次，每次间隔1 min。心房颤动定义为体表心电图P波消失，代之以不规则f波，RR间期绝对不等。记录每组大鼠的心房颤动诱发率(atrial fibrillation induction，AFI)。

2 结 果

2.1 各组血压、心率比较 与正常对照组比较，模型组SBP、DBP及MBP均明显增高(P<0.05)；与模型组相比，西药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组SBP、DBP、MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)；各组间HR比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组血压、心率比较(±s)

2.2 各组血清TNF-α、IL-6比较 与正常对照组相比，模型组、西药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组血清TNF-α、IL-6浓度均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，西药组、中剂量组血清TNF-α、IL-6浓度明显降低(P<0.05)，低剂量组血清IL-6浓度明显降低(P<0.05)。详见图1、图2。

与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 各组电生理检查结果比较 与正常对照组相比，模型组大鼠P波时限、PR间期、AFI均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，西药组、中剂量组大鼠P波时限明显降低(P<0.05)，西药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组AFI有下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，各干预组PR间期比较差异无统计学意义(P>0.05)，各组AERP120 ms、AERP150 ms比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心电参数比较

3 讨 论

目前，研究认为心房颤动的发生和维持有多种机制参与，其中心房的电重构与结构重构是心房颤动始动和维持的病理基础，而炎症反应在心房重构过程中可起到催化剂作用。炎症反应可增加肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)活性，并且促进血管紧张素Ⅱ的产生[4]，而RAAS的激活不仅可以参与高血压发病，也在高血压心房重构中发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ可以通过刺激促炎细胞因子(例如TNF-α、IL-6)的产生并直接激活免疫细胞来促进炎症反应[5]。慢性炎症反应的存在与高血压及心房颤动的发生和发展关系密切[6]，高血压伴随的炎症反应参与了心房电重构与结构重构，可进一步导致心房颤动的发生和维持，而心房颤动本身可在心房重构过程中诱发炎症，从而使心律失常永久化，即所谓的“心房颤动引发心房颤动”现象。TNF-α是具有多效性的促炎蛋白，是一种促进心肌细胞坏死的重要因子。有研究在分析心房颤动病人心房血清因子时发现，心房颤动病人TNF-α水平明显升高[7]。此外，TNF-α可提高心房自主神经节的活性和功能，并降低心房与肺静脉各位点的心房颤动阈值，参与了心房颤动的发生和维持[8]。IL-6作为调节体内免疫功能和代谢过程的细胞因子，是机体炎症反应和一系列病理生理过程的重要介质之一，IL-6在心房颤动病人血清中的表达明显高于正常人群[7，9]。

在心房颤动的临床及基础研究中，许多学者倾向于用“心房颤动易感性”来表示心房颤动诱发的难易程度，即额外刺激作用于心房时，诱发心房颤动的难易程度[10-11]。有研究显示，高血压和炎症反应会降低心房颤动的诱发难度，使心房颤动易感性增加[8，12]。高血压和心房颤动间的病理生理机制较复杂，在高血压性心脏病早期，几种不同心房电特性异常与心房颤动的发生和维持有关：如心房电传导速度延长、PR间期延长和AERP缩短及其离散度增加等[10，13-14]。心房电传导速度可通过P波时限间接反映，P波时限增加，提示心房电传导时间延长，P波时限与发生心房颤动的危险性呈正相关[15]，而PR间期则反映了房室传导的速度，Chun等[16]对207例频发性房性期前收缩病人进行为期8年的随访，结果提示PR间期延长是心房颤动发生的独立危险因素。Smith等[17]对14 924名社区人群进行了约21年随访调查，也发现PR间期延长与心房颤动风险增加相关。除了心房和房室传导速度外，AERP作为折返环形成的一个关键因素，在心房颤动的发生和维持中也起到了关键作用，然而在相关的疾病模型中，有关AERP的表现却存在不同报道。Lee等[18]对1 308例无结构性心脏病者进行12年的随访，结果发现AERP随着年龄的增长而增加，Cox回归分析显示AERP≥280 ms可以预示未来发生心房颤动的风险显著增加。有研究表明，阵发性心房颤动病人经环肺静脉消融术后，心房各部位有效不应期均较术前延长[19]。也有研究表明，在成年比格犬心房颤动模型中AERP明显缩短，而在增龄比格犬心房颤动模型中，AERP则显著延长[20]，考虑AERP除了和心房颤动有关，同时也与年龄变化等其他多个相关因素关系密切。

心房颤动属于中医学心悸、怔忡范畴，其基本病机有虚实两方面，虚者为气血阴阳亏损，心神失养所致；实者则多由痰热、水饮、瘀血、气血凝滞等实邪所致，虚实之间又多相互夹杂转化，其中，气虚、血瘀、痰热被认为是心悸的重要致病因素。心气虚不足以推动血液运行，形成瘀血；气虚无力布化津液，聚而生痰；郁久化热，形成邪热。参连复脉颗粒(原益气复脉合剂)是在总结首都国医名师廖家桢教授治疗心律失常的临证经验后拟定而成，方中以党参、丹参二药共为君药，有补脾益气、活血祛瘀、清心安神的功效；用黄连、法半夏为臣药，以辅助清热化痰、宁心止悸；赤芍、川芎、鬼箭羽三药合用佐助君药增强行气解郁、活血通络、宁心安神之功；白芍、远志、酸枣仁三药合用则佐助君药增强养心柔肝、安神止悸之效；炙甘草益气复脉、宁心止悸、调和药性，诸药合用共奏，以达到益气活血、清心化痰、安神复脉的功效。

本课题组前期临床研究显示，参连复脉颗粒(原益气复脉方)可降低病人24 h动态心电图室性期前收缩次数，改善心悸症状，疗效安全可靠[21]。本实验过程中，模型组动脉血清促炎因子TNF-α、IL-6明显升高(P<0.05)，说明动物模型出现炎症反应，而西药组、中剂量组与模型组相比，血清TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，低剂量组IL-6水平降低(P<0.05)，高剂量组数据出现改变趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，各组有效药物降低了体内TNF-α、IL-6水平，对全身炎症反应具有一定抑制作用，可能减轻了心脏细胞的损伤，对炎症造成的心房电重构和结构重构具有一定抑制作用，使心房颤动得到抑制。实验结果还显示，模型组大鼠较正常对照组AFI、P波时限及PR间期明显升高(P<0.05)，说明动物模型心房颤动易感性升高，其心房及房室电传导速度减慢；与模型组相比较，西药组与低剂量组、中剂量组、高剂量组AFI有下降的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，西药组和中剂量组P波时限明显降低(P<0.05)，低剂量组、高剂量组有降低趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，说明各组有效药物对心房颤动易感性具有一定改善作用，对部分心房电特性异常有抑制作用。本实验各干预组PR间期及各组大鼠AERP比较差异无统计学意义，考虑可能与样本量不足以及不同信号分子通路对心肌复极离子流的调节作用取得某种平衡有关。

综上所述，SHR血清炎性因子TNF-α、IL-6升高，P波时限延长，PR间期，AFI增加，心房颤动易感性明显增加；中药参连复脉颗粒可抑制SHR炎症反应，对部分心房电特性异常有抑制作用，有抑制心房颤动易感性增加的趋势。这些为中药参连复脉颗粒对高血压心房颤动的早期预防和治疗提供了依据。