miR-19a-3p对缺血性脑卒中调节机制的研究

缺血性脑卒中是威胁人类健康的主要疾病，具有高致死率、高致残率、高复发率等特点，而且其发病率仍在上升[1-3]。脑缺血损伤被认为是缺血性脑卒中最基本的一个复杂发病机制，涉及多种生命活动，如神经元凋亡[4]、星形胶质细胞活化[5]、促炎症反应和氧化应激[6]，脑缺血导致局部血液阻塞，大量缺氧、缺糖从而造成大脑损伤。尽管目前对脑缺血损伤的治疗有了长足的进展，但对于大量的脑缺血病人来说，其治疗效果仍不理想，究其原因主要是因为对病理过程缺乏清晰的认识。因此，阐明缺血性脑卒中的分子机制对于脑缺血损伤的有效治疗具有重要意义。

microRNAs(miRNAs)是一种短的非编码RNA，常见于转录后调控基因的表达，主要与靶向信使RNA的3′-非翻译区结合，从而达到调节细胞的活动[6]。现有研究表明miR-19a-3p是miR-17-92的一个重要组成部分，与肺癌、胃癌、乳腺癌、肝细胞癌等疾病的发生有关。此外，miR-19a-3p在胶质瘤细胞和星形细胞胶质瘤组织中过表达，并与胶质瘤病人的恶性程度密切相关，是胶质瘤发生的重要因素之一。更重要的是，miR-17-92簇在小鼠神经前体细胞中表达上调，miR-17-92无论是在培养的缺血神经前体细胞中还是在缺血动物的心室下区的过度表达都明显促进了细胞的增殖，而miR-17-92、miR-18a和miR-19a-3p单个成分的抑制，阻碍了细胞增殖并增强细胞死亡[7]，miR-19a-3p在脑缺血损伤中的作用机制尚不确切。因此，本研究观察大鼠体内脑缺血神经元损伤模型(I/R)和体外缺氧缺糖细胞模型(OGD)中miR-19a-3p在脑缺血损伤中的作用，以此阐明作用机制。

1 材料与方法

1.1 神经细胞和星形胶质细胞的分离培养 神经细胞：从新生sprague-dawley(SD)大鼠身上分离到原代神经元细胞。用0.125%胰蛋白酶消化海马组织10 min，分离离心后，将获得的神经元细胞接种于6孔板上，作用12 h。细胞维持在含2%B27、1%谷氨酰胺和阿糖胞苷的神经基础培养基，于37 ℃下5% 的二氧化碳环境中培养。为了建立OGD模型，神经元需在37 ℃、5%二氧化碳脱氧无糖Hanks平衡盐溶液中培养。95% 氮气处理24 h，然后在常温条件下培养即可。

星形胶质细胞：从新生SD大鼠中分离出原代星形胶质细胞。新皮质解剖后用0.09%胰蛋白酶处理25 min；获得的单个细胞离心接种于经聚d-赖氨酸(sigma-aldrich)处理的6孔板中；用Eagle′s Minimal Essential培养基，10% FBS、21 mmol/L葡萄糖和10% EGF(Gibco，USA)37 ℃和5%二氧化碳培养皮质星形胶质细胞。

1.2 大鼠缺血性脑卒中模型的建立 随机抽取6只正常饲养大鼠，(8～10)周龄，体质量(200±12)g，作为对照组；同时抽取6只正常建模缺血性脑卒中模型成年雄性SD大鼠，(8～10)周龄，体质量(200±12)g，作为I/R模型组。I/R模型由厦门大学医学院进行脑动脉阻塞建立而来，合格证号为SCXK2018-0008。所有大鼠均用浓度为100 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉。右侧颈内动脉、大脑中动脉尼龙线结扎90 min，自由活动24 h后处死，并提取细胞按照1.1中描述方式处理后，分为OGD模型组及正常培养的空白对照组备用。

1.3 葡萄糖代谢变化测定 用葡萄糖摄取比色分析试剂盒评估葡萄糖的摄取和乳酸的产生。乳酸比色测定试剂盒为Sigma Aldrich，USA提供。

1.4 蛋白表达检测(Western blot) 使用RIPA裂解缓冲液(Beyotime，上海，中国)分离总提取蛋白，并使用BCA试剂盒(Beyotime)进行检测。20 μg蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。随后使用LDHA(1∶1 000，Abcam，美国)、PKM2(1∶1 000，Abcam)、HK2(1∶1 000，Abcam)、Glut1(1∶1 000，Abcam)、PDK1(1∶1 000，Abcam)、Bim(1∶1 000，Abcam)、Bax(1∶1 000，Abcam)、caspase-9(1∶500，Abcam)、ADIPOR2(1∶1 000，Abcam)和GAPDH(1∶1 000，Beyotime)作为一级抗体，GAPDH作为对照进行检测。

1.5 TUNEL染色 使用TUNEL凋亡检测试剂盒(Beyotime)对细胞凋亡进行检测。TUNEL染色后，用DAPI孵育细胞，使用荧光显微镜(Fluoview FV1000，Olympus，日本)成像，并在5个随机场下计数。

2 结 果

2.1 miR-19a-3p在神经细胞和星形胶质细胞中的表达 神经细胞和星形胶质细胞对于缺血性脑卒中是两个重要的组成部分，实验结果发现miR-19a-3p在神经元和星形胶质细胞中的表达是不同的，miR-19a-3p在神经元细胞中的表达水平低于星形胶质细胞(P<0.01)。详见图1。I/R大鼠体内星形胶质细胞以及体外培养的OGD神经元细胞，miR-19a-3p表达上调(P<0.01)。详见图2、图3。表明miR-19a-3p可能参与或直接导致了缺血性脑卒中。

与神经元细胞比较，＊P<0.01。

与对照组比较，＊P<0.01。

与对照组比较,＊P<0.01。

2.2 I/R与OGD模型中糖代谢的抑制 缺血性脑卒中可导致细胞能量的丧失进而促使细胞死亡。检测I/R与OGD模型中糖酵解酶相关因子LDHA、PKM2、 HK2、 Glut1 和 PDK1的表达水平，同时检测葡萄糖摄取和乳酸的产生情况。I/R大鼠模型中，糖酵解酶相关因子LDHA、 PKM2、 HK2、 Glut1 和 PDK1表达水平低于对照组(P<0.01)；葡萄糖的吸收水平和乳酸生成水平也低于对照组(P<0.01)。可见保证葡萄糖代谢有助于改善缺血性脑损伤。详见图4～图6。

与对照组比较，＊P<0.01。

与对照组比较，＊P<0.01。

与对照组比较，＊P<0.01。

2.3 OGD模型中的细胞凋亡 用Tunel和Western Blot检测OGD模型中诱导的神经细胞凋亡及细胞凋亡相关蛋白。细胞凋亡标记物Bax、Bim和Caspase-9在OGD神经元中被检测到表达上调，但对照组中未检测到(P<0.01)。详见图7。

与对照组比较，＊P<0.01。

2.4 miR-19a-3p通过靶向脂联素受体2抑制葡萄糖摄取并促进神经元凋亡 为了探究miR-19a-3p表达与葡萄糖代谢的关系，将miR-19a-3p或抑制剂转染到OGD模型组，与对照组神经元细胞同时培养进行对照，观察其凋亡情况。实验发现当miR-19a-3p转染后，糖酵解酶的表达、葡萄糖摄取和乳酸生成均降低(P<0.01)。详见图8～图10。

与对照组比较，＊P<0.01。

与对照组比较，＊P<0.01。

与对照组比较，＊P<0.01。

2.5 脂联素受体2介导miR-19a-3p在脑缺血损伤中的作用机制 在缺血性脑卒中时，脂联素受体2是miR-19a-3p的功能效应器，尽管实验结果表明了脂联素受体2是miR-19a-3p的真正靶点，但此并不意味着miR-19a-3p在I/R损伤中的致病作用为脂联素受体2介导的。为了确定这一点，用带有靶点脂联素受体2的siRNA，单独或带有miR-19a-3p抑制剂去转染OGD神经元。脂联素受体2在对照组中沉默，而与miR-19a抑制剂共转染则减轻了葡萄糖摄取和乳酸的产生(见图11、图12)，miR-19a-3p介导的缺血性脑损伤至少部分是由于脂联素受体2的下调所引起的。

与对照组比较，＊P<0.01。

与对照组比较，＊P<0.01。

3 讨 论

本研究发现，miR-19a-3p在I/R和ODG模型中有着较高的表达，进一步实验表明，miR-19a-3p的抑制有效缓解了I/R/OGD诱导的糖酵解酶表达、葡萄糖摄取和乳酸生成，同时可通过靶向脂联素受体2调节神经元凋亡。因此，miR-19a-3p升高在脑缺血损伤发病中起着重要的作用。

星形胶质细胞被认为是中枢神经系统中数量最多的细胞，与神经元相互作用以维持中枢神经系统环境的稳定性。脑缺血后星形胶质细胞增生、代谢储备增强，神经元凋亡延迟。miRNA异常表达水平与脑缺血受伤模型相关[8]。miR-19a-3p被发现于各种癌症，尤其是星形细胞瘤，通常呈现过度表达水平[9]。此外，它的过度表达发生在培养的神经缺血中祖细胞和促进细胞增殖[10]，这意味着miR-19a-3p具有发挥神经细胞功能调节的作用。本研究观察到miR-19a-3p在星形胶质细胞中高表达，在神经元中低表达，提示miR-19a-3p可能对神经受损功能具有保护作用。

在脑缺血期间，由于完全停止缺血核心区的葡萄糖和氧气供应，导致神经细胞遭受不可逆转的损伤。因此，改善糖代谢和控制神经细胞凋亡对改善脑缺血损伤具有重要意义。尽管本研究结果没有显示出具体的特异下游效应器，但miR-19a-3p的修饰却影响着糖酵解酶和神经元凋亡过程。

ADIPOR2编码脂联素受体2，与心血管疾病、脂肪肝、糖尿病、糖尿病肾病和骨代谢紊乱有关。在每一种致病条件下，ADIPOR2的过度表达都能改善疾病的进程。ADIPOR2过表达和缺血性中风之间的相关性也已经被证实[11]。本实验证实了这些发现，并强调了检验腺病毒介导的ADIPOR2在脑缺血损伤的体内外模型中过表达将是一种可行的治疗干预措施。最近有报道表明，在脑缺血脑损伤代谢中，星形胶质细胞和星形胶质细胞-神经元会相互作用，星形胶质细胞有待进一步研究。此外，miR-19a-3p的其他靶点作用也需进一步研究。